摘要：【目的】明确凡纳滨对虾抗菌肽crunstinA（LvcrustinA）在毕赤酵母菌中的表达情况，为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础。【方法】采用全基因合成法（PAS）合成LvcrustinA基因，然后将LvcrustinA基因克隆至真核表达载体pYE-GAPα，所得重组质粒转化感受态细菌TOP10，以质粒提取试验盒提取的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转至毕赤酵母菌GS115；以SDS-PAGE电泳检测和Western blotting鉴定分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况，并通过保护试验验证融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌的抵抗作用。【结果】以构建的重组质粒pYE-GAPα-LvcrustinA电转毕赤酵母菌GS115，获得的重组菌株在30 ℃下摇床（220 r/min）培养24 h即可获得融合蛋白LvcrustinA，且随培养时间的延长，其表达量逐渐增多。Western blotting鉴定结果显示，纯化的融合蛋白LvcrustinA能被抗His抗体识别。保护试验结果表明，融合蛋白LvcrustinA对副溶血弧菌具有良好的抵抗力。【结论】利用表达质粒pYE-GAPα和酵母菌GS115可成功重组表达获得LvcrustinA，且获得的LvcrustinA具有促进凡纳滨对虾抵抗副溶血弧菌感染的作用。
关键词： 凡纳滨对虾；抗菌肽；毕赤酵母菌；真核表达
中图分类号： S945.46 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）07-1310-07
0 引言
【研究意义】抗菌肽（Antimicrobial peptides）又称抗微生物多肽或肽抗生素，是一类由生物细胞特定基因编码且经特定外界条件诱导产生的多肽（乔玮等，2014）。抗菌肽作为天然免疫防御系统的重要组成部分广泛存在于动植物体内，与其他抗菌药物相比，其具有分子量小、热稳定、广谱抗菌及无免疫原性等特点（Wang and Wang，2004；肖贵榜等，2015）。作为传统抗生素的替代物，抗菌肽越来越受到人们关注，尤其是抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域具有良好的应用前景，已成为当前国际学术研究的热点之一。【前人研究进展】抗菌肽是鱼、虾、贝类等水产动物防御系统的主要成分之一，且已有研究证实在水产养殖过程中添加抗菌肽可显著提高水产动物的生长速度、相对增重率、饵料系数、存活率及抗病能力等（Zhou et al.，2008；王自蕊等，2014；张庆华等，2014；覃志彪等，2016）。姜兰等（2002）将基因重组抗菌肽的发酵产物浓缩干燥后添加到饵料中，发现其对中华鳖红脖子病、赤斑病、穿孔病等常见病害具有一定的防治效果。姜珊等（2011）研究发现，在饵料中添加适量的重组抗菌肽能显著提高罗非鱼幼鱼的生长性能和部分免疫指标。林鑫等（2013）研究表明，投喂含抗菌肽饵料的锦鲤感染维氏气单胞菌后累积死亡率明显降低，表明口服抗菌肽可有效提高锦鲤的抗病能力。王自蕊等（2014）对饲喂天蚕素抗菌肽后的湘云鲫进行嗜水气单胞菌攻毒，结果发现攻毒48 h内死亡率极低，对应的存活率明显高于对照组，表明在饵料中添加天蚕素抗菌肽可提高湘云鲫的抗病力。此外，多数抗菌肽在很低的浓度水平下即可显示出强大而广谱的抗菌活性。Lauth等（2002）研究表明，来源于条纹鲈皮肤和鳃的抗菌肽Moronecidin对所有的革兰氏阳性菌和大多数革兰氏阴性菌均具有抑制作用，最小抑菌浓度（MIC）<20 μmol/L。Yin等（2006）研究表明，来源于点带石斑鱼的抗菌肽Epinecidin-1对副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有抑菌作用，MIC均低于5 μmol/L。除了具有广谱抗菌性能外，抗菌肽还能耐受饲料加工过程中的高温，规模化发酵生产抗菌肽的高温浓缩工序可同步杀灭其他菌体，在推广应用中不会出现因工程菌扩散而导致的环境生态问题（Chia et al.，2010；Zhao et al.，2010），因此在水产抗病饵料添加剂研发方面具有广阔的应用前景。【本研究切入点】对虾养殖是我国水产养殖的支柱产业之一，广西凡纳滨对虾产量居全国第二，其产值在广西水产养殖业中位居第一，但近年来随着对虾养殖业的快速发展，其病害问题日趋严重，尤其是对虾桃拉综合征和白斑综合征（冯东岳和钱冬，2011；衣启麟等，2014；马宁等，2015）。为预防和治疗对虾疾病，部分养殖户滥用或超标使用化学类消毒剂、抗生素类药品，在导致致病菌株耐药性增强、养殖水体受污染的同时给食品安全带来巨大隐患，因此以抗菌肽代替传统抗生素类药物对确保对虾养殖业健康发展具有重要意义。【拟解决的关键问题】将凡纳滨对虾抗菌肽crustinA基因（LvcrustinA）克隆至真核表达载体pYE- GAPα后转化毕赤酵母菌，分析融合蛋白LvcrustinA的表达情况，为研发出一种基于重组蛋白crustinA的新型水产药物打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
真核表达载体pYE-GAPα和感受态细菌TOP10由广西遗传育种与健康养殖重点实验室提供，毕赤酵母菌GS115购自Life公司，Protein Marker、鼠抗His单抗、兔抗鼠HRP、DNA胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒及Ni2+ IDA亲和层析胶购自北京全式金生物技术有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，ECL显色液购自北京普利莱基因技术有限公司，Acr、Bis、Tris等购自美国Sigma公司，SDS购自Amresco公司，其他生化试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：Allegra 21R台式高速冷冻离心机、Biologic LP層析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、PTC-200基因扩增仪、Hofer ΜV-25紫外透射仪、Gene Pulser Xcell电穿孔系统等。