[摘要] 目的 探讨JWA蛋白在食管鳞癌组织和细胞株中的表达及意义。 方法 采用蛋白免疫印迹技术检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织、人食管上皮细胞株（HET-1A）及食管鳞癌细胞株（EC109和KYSE510）中JWA蛋白的表达情况。 结果 食管鳞癌组织中JWA蛋白表达水平低于癌旁正常组织；JWA蛋白在3种细胞系中均有表达，其表达水平依次为HET-1A>KYSE510>EC109，表达量随食管鳞癌细胞转移潜能增高而递减。 结论 JWA蛋白可能与食管鳞癌的发生、发展及转移密切相关，可能成为基因治疗的一个潜在靶点。
[关键词] 食管鳞癌；JWA蛋白；免疫印迹
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）11（b）-0004-03
Expression and significance of JWA protein in human esophageal squamous cell carcinoma
GONG Ze-gang1 ZHOU Jian1 WANG Qian-qian2▲
1.Department of Thoracic Surgery，Affiliated Yixing People′s Hospital of Jiangsu University，Jiangsu Province，Yixing 214200，China；2.Department of Oncology，Affiliated Yixing People′s Hospital of Jiangsu University，Jiangsu Province，Yixing 214200，China
[Abstract] Objective To explore the expression and significance of JWA protein in human esophageal squamous cell carcinoma tissues and cell lines. Methods The expression levels of JWA protein were detected in the esophageal squamous cell carcinoma and matched adjacent non-cancerous tissues of patients，HET-1A，EC109 and KYSE510 by western-blot. Results The level of JWA were significantly lower in tumor tissue specimens than in the matched non-tumor tissue.All the three cell lines expressed JWA protein at different levels.The highest expression levels of JWA protein in HET-1A cells were seen and the lowest expression levels of JWA protein in EC109 were found.The levels of JWA protein were decreased as metastatic potential increased. Conclusion JWA may be closely correlated to the oncogenesis，development and metastasis，as well as a potential target for more effective therapy.
[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma；JWA protein；Western-blot
JWA是周建伟等人首先从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离克隆的受维甲酸（ATRA）诱导与细胞分化相关的新的细胞骨架样基因[1]，该基因编码在NCBI基因库中，编号为AF070523。先后证实该基因编码是一种新的微管相关蛋白（microtubule associated protein，MAP）并调节PC12细胞内兴奋性和抑制性氨基酸含量的平衡[2-5]。不仅广泛参与调节多种分化和（或）凋亡诱导剂（如TPA、ATRA、4HPR和As2O3）涉及的信号通路，还活跃地参与细胞对应激刺激（如氧化应激和热应激）的应答[1，6]，在应答多种环境因素处理下DNA损伤和修复中起着不可或缺的作用[7-8]。JWA在细胞恶性转化中起类似抑癌基因的作用，可能通过对突变型p53表达的下调来抑制细胞向恶性肿瘤细胞方向转变[9]。另外，JWA可通过MAPK信号通路调节肿瘤（如宫颈癌、乳腺癌、肝癌等）细胞的迁移[10]，但JWA蛋白在食管鳞癌中的表达及作用尚未见报道，为了研究其与食管鳞癌生物学特性的关系，本研究采用蛋白质印迹法检测JWA蛋白在食管鳞癌组织及不同食管鳞癌细胞系中的表达情况，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
山羊抗人JWA多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；DMEM购自Invitrogen公司；蛋白定量试剂盒及ECL化学发光检测试剂盒购于美国Pierce公司；Western-blot相关试剂为碧云天生物技术研究所产品。
1.2 临床食管鳞癌标本
收集江苏大学附属宜兴医院2012年1～12月收治的行食管癌根治术的25例新鲜食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织（距肿瘤边缘5 cm以上，经病理检查排除肿瘤累及）2处组织标本，男14例，女11例，年龄50～75岁，中位年龄67岁。术前均未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗。术后病理检查均证实为食管鳞癌。
1.3 细胞及细胞培养
人食管上皮细胞株（HET-1A）以及食管鳞癌细胞株（EC109和KYSE510），由本院实验中心保存。细胞培养使用DMEM（含10%胎牛血清）培养基，5%CO2、37℃条件下培养。细胞培养至对数生长期用于实验。
1.4 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹检测
组织蛋白：取-70℃保存的食管鳞癌组织及配对癌旁组织各100 mg，用4℃预冷的PBS（pH7.4）冲洗2次后加入细胞裂解液（含1%PMSF），用剪刀剪碎组织后研磨，静置40 min后，于4℃低温离心机中14 000×g离心15 min，取其上清（组织总蛋白）。细胞蛋白：细胞经传代长成单层后，弃培养液。4℃预冷的PBS（pH7.4）洗涤细胞，重复2次后加入细胞裂解液（含1%PMSF），静置40 min后，于4℃低温离心机中14 000×g离心15 min，取其上清（细胞总蛋白）。BCA法测定蛋白浓度。以50 μg/孔上样，SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭。山羊抗人JWA多克隆抗体（1∶300稀释）孵育，4℃过夜，洗膜，于辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育1 h，最后用ECL显影，曝光。采用Quantity One图像处理软件（Bio-Rad）进行蛋白印迹条带的定量分析，以微管蛋白（Tubulin）作为内参，计算相对值。
1.5 统计分析
所得数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，配对资料采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 JWA蛋白在食管鳞癌组织中的表达
JWA蛋白在食管鳞癌组织中的表达结果见图1。JWA蛋白分子量约为21.5×103。经Quantity One软件扫描并检测灰度值，食管鳞癌组织中JWA相对表达量为0.208±0.109，配对癌旁正常组织为0.538±0.080（图2），差异有统计学意义（P<0.01）。
图1 JWA蛋白在食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织中的表达
图2 JWA蛋白在食管鳞癌及配对癌旁正常组织中的表达差异
2.2 JWA蛋白在食管鳞癌细胞株中的表达
JWA蛋白在食管鳞癌细胞株中的表达结果见图3。食管上皮细胞株（HET-1A）以及食管鳞癌细胞株（KYSE510和EC109）相对表达量分别为0.647±0.089、0.378±0.055、0.192±0.032（图4），3组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。提示JWA蛋白在食管上皮细胞中表达量较食管鳞癌细胞中高，且随着食管鳞癌细胞侵袭能力的增强，JWA蛋白表达下调。
图3 JWA蛋白在HET-1A、KYSE510和EC109细胞系中的表达
图4 JWA蛋白在三种细胞系中的表达差异
3 讨论
肿瘤对周围组织侵袭性强，早期就发生邻近组织和远处组织的转移，是食管癌患者预后差的主要原因[11]。在食管鳞癌中，淋巴结转移普遍存在，甚至在肿瘤仅侵及黏膜下层时就可出现淋巴结转移。淋巴结转移也将直接导致不良预后[11]。因此，有效治疗食管鳞癌的关键是抑制肿瘤侵袭及转移。而细胞迁移则贯穿于肿瘤侵袭和转移的全过程[12-14]，是其限速环节。
既往研究表明，JWA表达异常与恶性肿瘤的发生、发展存在相关性，起到类似抑癌基因的作用，并可能通过下调突变型p53表达来抑制细胞向恶性肿瘤细胞方向转变[9]。Bai等[15]研究表明，JWA在良性痣中具有比较高的免疫反应性，而在恶性痣和黑色素瘤中表达很弱，此外，黑色素瘤细胞株中JWA的表达也低于正常黑色素细胞。本研究的研究结果与上述一致，JWA蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平较配对癌旁正常组织中低，并在细胞水平得到了验证，食管鳞癌细胞株（KYSE510和EC109）中JWA蛋白均较食管上皮细胞株（HET-1A）表达下调。进一步证实JWA表达异常与食管鳞癌有关。
JWA蛋白作为一种新的微管相关蛋白，参与细胞内物质转运和细胞迁移。Chen等[10]利用细胞穿孔模型研究发现，JWA表达增高可抑制HeLa、HCCLM3和B16等肿瘤细胞的迁移，JWA表达缺陷则促进上述肿瘤细胞的迁移。另外，Bai等[15]利用敲减JWA表达的黑色素瘤细胞株中做小鼠体内转移模型，证实下调 JWA 表达显著增强黑色素瘤细胞体内转移的能力。
食管鳞癌细胞株EC109和KYSE510来源并不同，EC109取材于中国食管鳞癌患者[16]，而KYSE510取材于日本食管鳞癌患者[17]。既往研究表明，EC109细胞的侵袭和转移能力较高，而KYSE510细胞则相对较弱[18]。这表明，EC109和KYSE510具有截然不同的肿瘤细胞恶性表型，是一对很好的研究食管鳞癌生物学特征的细胞模型。因此，本实验以这两种食管鳞癌细胞系为研究对象，以人食管上皮细胞株（HET-1A）为对照，探讨JWA对食管鳞癌细胞侵袭和转移能力的影响。结果显示，JWA蛋白在3种细胞系中均有表达，且随着肿瘤的进展及其侵袭、转移能力增高，JWA蛋白表达下调。这与吴晓峰等[19]用不同转移潜能的肝癌细胞研究发现的JWA表达水平随着肝癌细胞转移潜能的增高而递减的结论相吻合。提示JWA对恶性肿瘤的转移具有普遍意义，是一个保护性基因。
综上所述，JWA蛋白在食管鳞癌中表达下调，且可能抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力，为深入研究食管鳞癌的发病机制，寻找新的治疗靶点提供了初步实验室数据。
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（收稿日期：2013-09-26 本文编辑：林利利）