【摘要】 目的：探讨脂多糖对食管鳞状上皮细胞的骨形态蛋白4（BMP4）表达的影响。方法：体外培养正常食管鳞状上皮Het-1A细胞，采用不同浓度脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）处理细胞、实时荧光定量PCR与蛋白印迹分析方法测定BMP4及Smad1表达的变化，并对其进行相关性分析。结果：10 ng/mL LPS组可轻微刺激食管鳞状上皮细胞表达BMP4、Smad1的表达，与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；100 ng/mL LPS组和500 ng/mL LPS组均明显增强BMP4和Smad1的表达，且随浓度增强效应增强，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：脂多糖可能通过诱导BMP4及BMP信号通路相关蛋白Smad1的表达参与Barrett食管的发生。
【关键词】 脂多糖； 食管鳞状上皮细胞； BMP4； Barrett食管
【Abstract】 Objective：To explore the effect of Lipopolysaccharide on BMP4 expression in esophagus squamous cells.Method：Primary Het-1A cells were treated with Lipopolysaccharide at different concentration.The changes of expressions of BMP4 and Smad1 were examined by real time polymerase chain reaction and Western blot analysis.Result：10 ng/mL LPS group could slightly stimulate the expression of BMP4 and Smad1 in the squamous epithelial cells of the esophagus，there was no significant difference compared with the control group（P>0.05）.The expressions of BMP4 and Smad1 were obviously enhanced in the 100 ng/mL LPS group and the 500 ng/mL LPS group，and the difference was statistically significant with the enhancement of the concentration enhancement effect （P<0.05）.Conclusion：Lipopolysaccharide can regulate the expressions of BMP4 and Smad1，which may play a role in the development of Barrett oesophagus.
【Key words】 Lipopolysaccharide； Esophagus squamous cells； BMP4； Barrett esophagus
First-author’s address：Huadu District People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510800，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.007
Barrett食管（BE）是指食管遠端鳞状上皮被化生的柱状上皮取代的病理现象，是公认的食管腺癌（EA）的癌前病变[1]。既往研究认为，BE的病因主要为胃酸、胆汁酸、胃蛋白酶等反流物对食管上皮细胞慢性损伤的结果，但接近40%的BE患者无GERD症状发生[2-3]。近年来菌群失调在消化系统疾病中的作用得到广泛重视，相关研究发现，与正常食管相比，BE和食管炎末端形成量种截然不同的微生物类型，BE和食管炎末端包含大量微生物革兰阴性菌（G-）占53.4%，而在正常食管黏膜中多为革兰阳性菌为代表的厚壁菌门，G-菌只占14.9%。由此笔者推测除胃酸和胆汁刺激外，菌群变化导致炎性因子LPS增高是BE发生的重要致病因素[4]。在正常成年人的食管黏膜中不表达的BMP4在BE和胃食管反流病的食管鳞状细胞中表达异常上升[5]，而骨形成蛋白（BMP4）信号传导通路激活可以诱导鳞状上皮细胞向肠化柱状上皮细胞的方向分化，是BE的标志蛋白[6]。笔者推测LPS可激活BMP4信号传导通路参与BE的发生和发展。本研究采用Real-time PCR、Western blot分别检测经过不同浓度LPS处理后，正常食管鳞状上皮Het-1A细胞BMP4、Smad1的表达变化，探讨LPS对BMP4及Smad1表达的影响，为深入认识BE的发生发展提供新线索，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Het-1A细胞株购自上海序润生命科技有限公司，DMEM培养基购自Gibco公司，脂多糖购自sigam公司，实时荧光定量PCR所用的互补DNA第一链合成试剂盒购自天根生物科技有限公司，快速SYBR Green Master Mix试剂盒购自美国ABI公司，引物由公司设计合成上海英骏生物技术有限公司，一抗BMP-4、Smad1/5、均购自武汉博士德公司。
1.2 Het-1A食管上皮细胞培养 细胞经消化传代，以DMEM加15%的胎牛血清作为培养液，于5%CO2的37 ℃温箱中进行培养，每周换液2～3次，待细胞密度达80%以上进行试验。
1.3 LPS处理细胞 无血清及添加物的培养基培养细胞24 h。应用无血清及添加物的培养基调制LPS浓度分别为10、100、500 ng/mL。应用不同PLS浓度的培养基处理24 h，然后继续以无血清及添加物的DMEM培养基培养细胞至24 h。
1.4 实时荧光定量PCR 处理后的细胞提取RNA进行反转录和PCR。GAPDH为内参照物，BMP上游引物为5’-AGGAAGCAGTCTGTGTAGTGTG-3’，下游引物5’-GATGTAGTAGAGGGATGTGGG-3’；Smad1上游引物为5’-CTGCCCTCAGAAATCAACAGAG-3’，下游引物5’-GTGAAACCATCCACCAACACAC-3’；GAPDH上游引物为5’-CCCTTCA TTGACCTCAACTACATGG-3’，下游引物为5’-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3’。用2-ΔΔCt值分析各组细胞中BMP4、Smad1相对表达量。每组实验重复3次。
1.5 蛋白印迹分析（Western blot） Western blot检测细胞BMP4和Smad1蛋白表达：以GAPDH为内参照物，将细胞裂解液加入至各组细胞中提取总蛋白，将蛋白溶液和上样缓冲液按2︰1混合均匀，于沸水浴中加热5 min。于SDS.PAGE系统中进行上样并电泳分离，转印至PADF膜上，经封闭、一抗（1︰10 000 Rabbit anti-GAPDH以及1︰1 000 Rabbit anti-BMP4、Smad1）和二抗（1︰5 000羊抗兔IgG/HRP）孵育后，将化学荧光发光底物均匀地添加至PADF膜的表面，持续反应5 min。用试剂盒的滤纸除去PADF膜表面多余的底物溶液，放置于暗盒中进行曝光并显影定影。结果以不同浓度的BMP4、Smad1/5与GAPDH的吸光度比值代表各样本BMP4、Smad1/5的相对含量。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脂多糖对Het-1A中BMP4表达的影响
2.1.1 BMP4 mRNA表达 在培养基浓度100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS组中，食管鳞状上皮细胞的BMP4 mRNA水平分别是对照组的2.20、3.59倍，效应差异存在显著性（P<0.05）。10 ng/mL LPS组BMP4 mRNA水平与对照组对比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.1.2 BMP4蛋白表达 正常食管鳞状上皮细胞和低浓度10 ng/mL LPS组无不表达BMP4，100 ng/mL LPS组可促进BMP4的表达，且随浓度增强效应增强，见表1和图1。
2.2 脂多糖对Het-1A中Smad1表达的影响
2.2.1 Smad1 mRNA表达 对照组食管鳞状上皮细胞和10 ng/mL LPS组 Smad1 mRNA均呈低水平表达，差异无统计学意义（P>0.05），而100 ng/mL LPS组和500 ng/mL LPS组基因转录增强，分别是对照组的1.73、2.56倍，效应差异存在显著性（P<0.05），见表2。
2.2.2 Smad1蛋白表达 对照组和10 ng/mL LPS组均低表达Smad1，100 ng/mL LPS组可促进BMP4的表达，差异无统计学意义（P>0.05），见表2和图1。
3 讨论
近年来，大量研究显示胃肠道微生态系统失衡与人体疾病有着密切的关联[7-8]。Gall等[9]发现在Barrett食管患者中，链球菌与普氏菌为其主要菌群，比值越大，Barrett食管发生风险越高，并且与早期食管腺癌有明显相关性。脂多糖（LPS），革兰阴性菌主要的外膜结构，能够诱导宿主固有免疫反应，通过激活Toll-4受体和NF-κB的途径上调促炎细胞因子的基因表达诱导炎症反应[10]。研究发现，在反流性食管炎-BE-腺癌的进展过程中，NF-κB的活性逐渐上调，并伴Cdx2的表达水平同时上调[11-12]。此外LPS能够通过诱导一氧化氮合酶和延迟胃排空的环氧酶-2的生成使下食管括约肌松弛导致反流性食管炎[13-14]。目前，大多数观点认为，食管化生过程与食管长期暴露于胃酸、胆汁酸、胃蛋白酶等反流物等导致慢性炎症反应有关[15-16]。但部分患者无反流症状，24 h pH检测无明显酸反流。因此笔者推测菌群变化LPS表达的升高可能通过诱导炎症反应导致Barrett食管的发生，同时可通过松弛下食管括约肌和延迟胃排空促进胃酸、胆汁酸、胃蛋白酶反流促进疾病的演变。
BMP4可诱导细胞凋亡、生长和分化，是上皮-间充质转化过程的关键信号分子。Smads是信号转导因子，可直接由从细胞膜将BMP4信号转导入细胞核内[17]。目前BE食管的具体化生过程仍不清楚。研究发现，BMP参与CDX2的调控，通过促CDX2的表达影响Be的形成[18]。
研究中笔者发现，正常食管鳞状上皮细胞并不表达BMP4，10 ng/mL LPS组培养基可轻微刺激BMP4表达，但差异无统计学意义（P>0.05），而100 ng/mL LPS组和500 ng/mL LPS组则明显增强BMP4表达（P<0.05）。提示，LPS可以促进食管鳞状上皮细胞BMP4的表达，而且LPS浓度与BMP4表达强度正相关。正常食管鳞状上皮细胞Smad1表达较低，而LPS可促进 Smad1表达，且LPS浓度与Smad1表达强度正相关。而Smad1表达增强可促进行细胞内的BMP4信号传递，并且激发后续的信号级联放大效应，促进BE的化生[19-20]。
综上，LPS可通过BMP4和BMP4通路蛋白Smad1表达参与BE的发生。探索了BE发生和BMP4在BE上调的可能机制。益生菌的治疗可能通过抑制LPS预防BE甚至食管腺癌发生。但结论仍需进一步研究证实，如LPS影响BMP4表达的具体分子机制，LPS与酸及胆盐之间的关系等，由于Barrett食管是多种复合事件共同作用于食管黏膜层面的结果，因此需要综合更多方面因素进行深层次研究。
参考文献
[1]杨小平.食管癌及Barrett食管的发病趋势、流行病学、内镜及病理特征分析[D].广州：南方医科大学，2015.
[2]夏一菊.KLF5在DCA介导下诱导食管鳞状上皮向柱状上皮转分化的作用及机制研究[D].重庆：第三军医大学，2016.
[3] Sharma N，Ho K Y.Risk factors for Barrett’s Oesophagus[J].Gastrointest Tumors，2016，3（2）：103-108.
[4]刘宝珠，李晓艺.Barrett食管32例临床病理分析[J].基层医学论坛，2016，20（26）：3700-3701.
[5]崔曼莉，王景杰，张明鑫.微生态在食管疾病中的意义[J].世界华人消化杂志，2018，26（5）：289-295.
[6]杨浩羿.CDX2、BMP4在Barrett食管及食管腺癌中的表达及意义[D].贵阳：贵阳医学院，2015.
[7]闫武.BMP4信号通路与KLF4在Barrett食管形成中的作用研究[D].重庆：第三军医大学，2016.
[8]戴琼，顾思岚，石鼎，等.人体肠道微生态与疾病发生发展的关系及机制研究进展[J].中国微生态学杂志，2016，28（5）：614-617.
[9]沈小雪，俞汀，林琳.胃肠道微生态系统与胃食管反流病关系的研究进展[J].胃肠病学，2017，22（4）：245-248.
[10] Gall A，Fero J，McCoy C，et al.Bacterial composition of the human upper gastrointestinal tract microbiome is dynamic and associated with genomic instability in a Barrett’s esophagus cohort[J].PLoS One，2015，10（6）：e0129055.
[11]刘利，解启莲，李小双.亚低温抑制BV-2细胞脂多糖诱导的Toll样受体4活化和炎症因子表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2015，31（11）：1479-1482.
[12]王少鑫，靳宝锋，崔立红.锚蛋白重复序列通过NF-κB信号通路参与肠炎相关肿瘤的调控[J].世界华人消化杂志，2015，23（2）：189-195.
[13]杨建杰，张玉林.COX2、CDX2在糜烂性食管炎、Barrate食管及食管腺癌中的表达及意义[J].检验医学与临床，2017，14（11）：1621-1623.
[14]郭晓燕，王婷，董蕾，等.一氧化氮合酶在胃食管反流病患者食道黏膜的表达[J].西安交通大学学报（医学版），2015，36（3）：373-377.
[15]肖兰.一氧化氮合酶、白细胞介素-8在不同类型胃食管反流病中的表达及意义[J].陕西医学杂志，2017，46（6）：778-780.
[16]戴结.EGCG抑制胃食管反流物诱导的人食管上皮细胞NF-κB激活的研究[D].南京：南京大学，2013.
[17]陈志浩，李政奇，王贵齐.食管腺癌发生发展与慢性炎症的相关性研究[J].中国肿瘤，2017，26（9）：721-726.
[18]吴倩倩，孙琦，黄勤，等.TGF-β/Smads信号转导通路与胃癌关系的研究进展[J].胃肠病学，2015，20（1）：55-57.
[19]房渝，陈浩，陈晓欣.Barrett食管发生的分子机制[J].中华消化内镜杂志，2011，28（8）：428-431.
[20]李萍英.Barrett食管的分子生物学研究进展[J].青海医药杂志，2012，42（3）：93-96.
[21]房殿春.Barrett食管发生机制的研究進展[J].现代消化及介入诊疗，2012，17（2）：89-92.