材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞及主要试剂 从喉癌组织悬液提取的人喉癌上皮细胞；胎牛血清（NycoPrep公司）；HRP标记的优质内参（上海康成生物）；CRT抗体abcam；RIPA裂解液[碧云天（北京）]；Goat Anti-Rabbit IgG[Southern Biotechnology，Inc（USA）]；SDS-PAGE试剂[Abcam，Inc（UK）]；Peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG[博士德生物（武汉）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen）。
1.1.2主要仪器 流式细胞仪[BD Inc（USA）]；定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix[Invitrogen Inc（USA）]；倒置荧光显微镜[Leica Inc（Germany）]；细胞恒温培养箱[Thermo Fisher Scientific Inc（USA）]。
1.2主要实验方法
1.2.1单细胞悬液制备 取少量喉癌组织约0.5 g置于匀浆器中，清洗后仔细剔除脂肪、坏死组织、纤维及结缔组织；用干净的组织剪将组织充分剪小、剪碎并不断轻微揉搓，置120目不锈钢网上，然后边轻搓边用纯净水不断冲洗，静置待自然沉淀后收集喉癌组织细胞混悬液；将混悬液用300目尼龙细网再次过滤，静置后收集细胞悬液。将此悬液置于离心机1200 r/min，离心2～5 min，弃上清液后再次1200 r/min离心2 min，弃上清液后加入1 ml PBS将细胞悬浮，记数并调整细胞浓度为1×106/ml。
1.2.2 RT-PCR 按照TRIzol的操作说明对组织蛋白进行RNA提取，用紫外分光光度仪进行总RNA定量后，按逆转录酶反转录体系推荐的2 μg RNA反转录，并用于做q-PCR。使用Primer Premier 5软件设计引物，β-actin为内参照；β-actin-F：5′-TGCATGAGGATGCAGCAGTT-3′，β-actin-R：5′-TCCGCGACAATGTGATCTTA-3′；扩增片段大小：β-actin为235 bp；CRT-F：5′-CTAGATGAGTTGAAGCAGTG-3′，CRT-R：5′-CGGGATCTAATATGTGTCTC-3′；目的片段：CRT为225 bp。以（Oligo）dT作为引物据序列互补原则，利用逆转录酶逆转录合成cRNA第一链后，取5 μl cRNA为模板再进行PCR扩增；PCR管中依次加入第一链cRNA、上游下游引物各5 μl、2xSYBR Green qPCR SuperMix 10 μl、Dntp5 10μl、Taq酶（2 U/10 μl）210 μl，适量ddH2O加至共体积20 μl，轻轻混合均匀离心，设定参数后在实时荧光定量PCR仪上扩增，行琼脂糖凝胶电泳后查看试验结果。设置以喉癌组织标本细胞作为试验的实验HEP2-A组，与来自未经任何处理的正常机体细胞作为试验的对照HEP2-B组。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 32 s读板，40 cycles。
1.2.3 Western blotting 根据制备的细胞悬液喉癌细胞量加入相应RIPA裂解液，匀浆置冰，裂解30 min后（过程中要经常指弹便于充分裂解）常规提取细胞蛋白行蛋白的初步定量分析；取样品50 μg，与上样缓冲液按2∶1混合，沸水浴5 min充分混合均匀；配制4%的浓缩胶，经SDS-PAGE电泳（80 V恒壓50 min，或60 V转移2 h，或40 V转移3 h，转完出现溴酚蓝刚出胶底部止）、转膜至常规PVDF膜，5%的脱脂奶粉TBST溶液封闭1 h，一抗4℃过夜、二抗37℃孵育1 h，TBST液洗涤5 min×3次，加入Immobilon Western Chemilum HRP Substrate，杂交膜表面上反应5 min，去尽残夜，滤纸吸净多余底物溶液，备好1×显影液和定影液，于暗室中曝光、显影、定影。同时设置以β-actin为内参照，同样以喉癌组织标本细胞作为试验的实验组，而来自未经任何处理的正常机体细胞作为对照组；应用凝胶图像处理分析系统软件进行图像扫描分析。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组内两两数据比较采用t检验或单向方差分析，多组间数据比较采用F检验，以P<0.05为差异有统计意义。
2结果
2.1 RT-PCR
试验样品经琼脂糖凝胶电泳，通过分析5、15、20 s rRNA 3条带谱，其完整性系数提示纯度检测无蛋白污染；完整性检测Total RNA抽提完整（图1）。结果显示，CRT mRNA于喉癌细胞mRNA表达有明显升高，实验HEP2-A组的表达阳性率升高67%，高于设置的对照HEP2-B组（t=3.20，P<0.05），CRT-mRNA表达差异有统计学意义（F=31.17，P<0.05）（表1）。
2.2 Western blotting
分别将对照组、实验组提取细胞蛋白并检测细胞CRT蛋白表达水平，结果显示，与对照组比较，实验组目的基因在喉癌细胞中有显著的蛋白表达提升，经过对其灰度分析后显示目的蛋白在喉癌细胞中较对照组提升71%CRT的表达；而非靶向蛋白β-actin的表达无影响；分析CRT蛋白表达率与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）（图2）。
3讨论
CRT最初被认为是内质网（endoplasmic reticulum，ER）上的钙离子结合蛋白，其进化过程中具有高度保守性，最初是從兔骨骼肌的内质网分离提取而来；近年研究发现其在细胞外也有表达，其蛋白由单基因编码，具有多种生物学功能，包括蛋白加工、细胞内钙离子的调节、抑制瘤体血管增生和参与抗原递呈及肿瘤瘤体细胞凋亡等各项功能。另外，CRT在肿瘤胞膜稳定完整的表达可促进某些肿瘤的免疫原性凋亡，使肿瘤细胞对凋亡信号刺激的感受性增强[3]。在肿瘤的实际治疗过程中，免疫治疗与化疗往往很难很好地结合在一起，患者经过几个疗程的化疗之后，体内大量的免疫效应器被破坏，所以针对肿瘤的抗原免疫反应在体内很难产生。研究发现CRT过度表达的肿瘤细胞对放、化疗而诱发的胞体凋亡更显敏感，在细胞表面被作为凋亡细胞的标志，可以作为信号刺激因子被吞噬细胞识别和吞噬，从而引起肿瘤细胞的免疫原性凋亡；还可通过阻止Akt信号转导、改变Ca2+稳态来调节P53功能，以调整其诱发细胞凋亡[4]。此外，凋亡肿瘤细胞表面的CRT还可能被抗原呈递细胞-树突状细胞识别，从而促进清除凋亡细胞，参与抗原提呈和活化特异性的免疫应答反应[5]。近年来的研究显示，CRT从细胞的ER移位到胞膜是凋亡细胞免疫原性的重要标志，这种生物学上的转移决定特异性抗肿瘤免疫应答的产生，利于肿瘤的优化性治疗，提示CRT与E6或E7联合的疫苗均使置瘤的荷瘤实验小鼠产生了抗E6或E7的显著T细胞特异性免疫应答[6-8]。CRT的表达促进肿瘤细胞的主动性免疫原性死亡，有利于清除残瘤肿瘤细胞，这为以后的抗肿瘤治疗提供了一种可能有效的免疫治疗新靶点。在临床肿瘤诊断方面，多种肿瘤细胞表面CRT及其裂解片段较正常组织有差异性表达量的改变，这为肿瘤的诊断提供了有利的帮助，这种发生、发展及预后密切相关性[9-10]，提示其可能成为新肿瘤标志物的潜在价值备选因子之一，以后有望在肿瘤的早期诊断及疾病预后判断发挥作用。在膀胱癌的研究中，通过检测尿中CRT发现其表达量也明显增加，考虑是否将CRT作为潜在生物学标志应用于早期诊断[9]。另外，在结肠癌、宫颈癌、神经母细胞瘤中，尤其在高度恶性和低分化区域，CRT的高表达直接关系到肿瘤的进展，提示CRT与肿瘤细胞的生长、分化、转移和预后有直接的关系[10-11]。另用含有特异性CRT融合基因载体和含CRT的基因疫苗免疫实验小鼠，结果观察到荷瘤小鼠的抗瘤效应非常明显，并且多次试验后发现其诱导并强化了荷瘤小鼠的免疫记忆细胞，这为将来的肿瘤治疗性疫苗的开发研究迈出了不可或缺的关键一步[12-17]。
本研究中，为了进一步明确CRT在喉鳞状细胞癌中作用，笔者将喉癌组织通过荧光定量PCR、Western blot，检测CRT在mRNA与蛋白水平上的差异性变化。结果显示，喉癌组织CRT的mRNA和蛋白表达水平显著升高，初步提示CRT可能参与了喉癌的发生、发展过程，其表达上调在喉癌进展中发挥了重要的作用。
综上所述，CRT可能是喉鳞状细胞癌一个潜在的基因治疗靶点。但是，因肿瘤的发生及发展的多因素复杂性，可能涉及相关多基因[18]，CRT单独或联合其他基因的综合治疗性实验研究还有待进一步证实；CRT能否真正成为喉癌临床治疗的有效靶点，还需进一步的深入研究。
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（收稿日期：2018-09-04 本文编辑：祁海文）