材料与方法
1.1 试验材料与仪器 试验所用的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）购自中国科学院武汉水生生物研究所（藻种库编号905）。草甘膦原药购自Iprochem 公司（广东深圳），其他所有试剂均为分析纯度。主要仪器为多功能酶标仪（Tecan infinite 200pro）和紫外可见光分光光度计（UV1901）。
1.2 试验方法
1.2.1 铜绿微囊藻的接种和培养。新购的藻种采用BG11培养基，经过反复接种2～3次后，再进行大规模培养。每次试验的初始接种量约为106个细胞/ml藻液，培养3～4 d后，铜绿微囊藻即进入对数生长期，采用此时的铜绿微囊藻进行毒理学试验。试验时一次性加药，连续培养4 d，每个处理设置4个平行。培养箱的温度26±1 ℃，光照强度2 000 lx，光暗比为14 h∶10 h。培养容器为500 ml透明大三角瓶，瓶口用4层纱布密封，以防止被外界环境污染并可保持气体流通。每天定时摇瓶3～4次，培养中始终保持光照条件均等。
1.2.2 铜绿微囊藻生物量和蛋白含量的测定。为测定铜绿微囊藻的生物量，先利用血细胞计数法数出细胞个数，再在680 nm下测出相应的吸光度，由细胞个数（C.D.）对吸光度（OD）作图，得到一条标准曲线（C.D.=110.79×OD680+0.136 6，R2=0.996 1）。此后根据测得的样品吸光度，计算样品的细胞密度。铜绿微囊藻蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，利用市售的试剂盒（南京建成生物工程公司）进行。
1.2.3 铜绿微囊藻细胞内的抗氧化酶活性及MDA含量的分析方法。收集培养4 d的藻液，每个样品取30 ml，在4 ℃下6 000 r/min冷冻离心10 min，弃去上清液，余下的铜绿微囊藻沉淀加5 ml 的PBS磷酸缓冲液和几粒石英砂，在冰上研磨，冷冻保存。经过1～2次冻融，铜绿微囊藻细胞内的酶则释放出来，此时再在4 ℃下，2 500 r/min冷冻离心10 min，取上清液，利用分光光度法进行过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）3种酶的活性以及脂质过氧化水平丙二醛（MDA）含量的测定和分析。具体分析都是采用购自南京建成生物工程公司的标准试剂盒进行。
1.2.4 藻细胞内外各种形态磷的测定。所有形态磷都先转化为正磷酸盐，然后用钼蓝显色法进行测定。磷标准曲线由K2HPO4标准溶液绘制，试验时现用现配。所有结果中的含磷量以mM P（mmol/L P）来表示。
1.2.4.1 细胞内外的正磷酸盐测定[11]。取铜绿微囊藻藻液10 ml，6 000 r/min离心10 min。上清液直接取出用于细胞外正磷酸盐测定；沉淀经过10% 的三氯乙酸提取后，调节pH至中性，用来测定细胞内正磷酸盐。
1.2.4.2 细胞内外的总磷测定[11]。同样取铜绿微囊藻藻样10 ml，6 000 r/min离心10 min。上清液加1.0 g过硫酸铵和0.15 ml浓硫酸，水浴加热（90～100 ℃）消化1.5 h。冷却后调pH至中性，定容显色后测定细胞外总磷含量；离心所得的沉淀先由6 ml蒸馏水取出，加4 ml 5% 的过硫酸铵，121 ℃消化30 min，冷却后仍将pH调至中性，定容显色后测定细胞内的总磷含量。
1.2.5 数据处理。利用SPSS18.0软件进行统计显著性分析（ANOVA法）和作图。当P<0.05时，处理间存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 不同浓度草甘膦暴露下铜绿微囊藻生物量的变化
由图1可知，随着草甘膦浓度的增加，铜绿微囊藻的生物量先增加后减小，在10 mg/L时达最大；当草甘膦浓度升至20和40 mg/L时，铜绿微囊藻的生长又显著被其抑制。最新的研究也发现，外源性污染物质如邻苯二甲酸二丁酯（DBP）对铜绿微囊藻生长的影响也是较低浓度促进，但较高浓度抑制[12]。这说明外源性污染物质对微囊藻生长的影响与污染物浓度密切相关。
2.2 不同浓度草甘膦暴露下铜绿微囊藻蛋白含量的变化
由图2可知，随着草甘膦浓度的变化，铜绿微囊藻蛋白含量的变化趋势与生物量完全一致。在草甘膦濃度较低时（5和10 mg/L），与空白相比，该除草剂刺激铜绿微囊藻蛋白的合成，尽管这种刺激效应不显著，但在草甘膦浓度较高时（20和40 mg/L），对铜绿微囊藻蛋白的合成有显著的抑制效应。蛋白是微囊藻细胞各种亚结构形成及一些重要的信号传导通路中不可或缺的成分。由图1和2可知，正是由于低浓度农药的刺激作用，使得蛋白质的合成量增加了，也就使得这些处理组的生物量也相应增加；而高浓度组毒害效果明显，首先是蛋白含量明显下降，这将影响铜绿微囊藻一系列的生理生化反应，如氧化应激系统受到影响。
2.3 草甘膦对铜绿微囊藻细胞内抗氧化酶的活性与MDA含量的影响
由图3可知，与空白相比，在草甘膦浓度较低时，CAT和POD活性略被刺激，但在高浓度时被显著刺激，说明草甘膦的加入使得藻细胞受到了抗氧化损伤，进而清除这种损伤的相关酶类的活性被显著激活了，特别是在高浓度组。所不同的是，SOD活性在低浓度时被显著抑制，但在高浓度时又被显著刺激。MDA是反映生物受到过氧化损伤的重要指标。与空白相比，所有添加除草剂的处理组，其MDA含量都有所增加，说明铜绿微囊藻确实受到草甘膦引起的氧化损伤。任何导致活性氧物质（ROS）形成的生物或非生物胁迫都可以产生氧化胁迫，植物或微生物运用自身的抗氧化防御系统来抵御这种氧化损伤，各种抗氧化酶是生物体内最有效的抗氧化损伤的武器[13]。CAT是用来清除活性氧物质H2O2的，而POD在植物体内的催化反应也是以H2O2等自由基为底物。同时，POD也是组织老化的一种生理指标。试验结果表明，高浓度加药组藻细胞的变色和沉淀现象较为明显，这也证明了细胞在走向老化和衰亡。另外，在高浓度组，草甘膦对微囊藻细胞的损伤仍旧不可逆转，进而使得高浓度处理组生物量和蛋白合成显著被抑制（图1和图2）。所不同的是，SOD是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，它能催化生物体内的ROS生成超氧自由基（·O2-）。尽管高浓度组SOD的活性被显著激活，但在草甘膦浓度较低时，SOD活性被显著抑制（图3c），这种抑制作用可能造成微囊藻体内·O2- 的累积，同样也引发微囊藻的氧化损伤（图3d）。
2.4 草甘膦加入对铜绿微囊藻细胞内外磷利用情况的影响
研究表明，在水体中各种形态的磷中，只有正磷酸盐才可被生物直接利用。部分有机磷农药的加入，改变了这部分磷占总磷的比例，进而有可能改变水中铜绿微囊藻对营养成分磷的利用情况。由图4可知，细胞外正磷酸盐所占比例在草甘膦浓度为5 mg/L时达最大，20 mg/L时降至最低，但细胞外总磷含量最大。LI等的最新研究发现[14]，铜绿微囊藻可以通过调节其生理代谢功能来适应外界环境的变化，当外界正磷酸盐浓度不足时，也可以利用溶解性的有机磷。试验结果表明，溶解性较好的除草剂草甘膦在浓度为5和10 mg/L时，的确刺激了微囊藻的生物量和蛋白合成，这可能是由于草甘膦的加入使得培养液中微囊藻可以直接利用的正磷酸盐的比例和含量都增加了。
由图5可知，在草甘膦浓度为10 mg/L时，尽管此时细胞内的总磷含量最低，但藻细胞可以直接利用的正磷酸盐比例却最高；而草甘膦浓度为40 mg/L时，总磷浓度较高，但藻细胞能直接利用的正磷酸盐含量和比例均最低。这表明较低浓度的除草剂可以改善微囊藻体内磷营养的存在状态，进而刺激微囊藻生长，而高浓度除草剂则降低磷营养的可利用性，从而抑制了微囊藻的生长。研究表明，在黑暗和氧化还原电位下降等逆境中，铜绿微囊藻细胞内磷代谢的状况会发生改变。例如，细胞内部聚合磷酸盐的积累速度和磷释放速度会大大增加，这就有利于维持必要的磷浓度并储存一定的能量，进而维持藻细胞正常的生理功能[15]。该试验中外源污染物草甘膦也是一种逆境胁迫，低浓度时明显改善了铜绿微囊藻细胞内可直接利用的磷的比例，最终表现为生长刺激现象。
3 结论与讨论
（1）在实际环境中，低剂量刺激、高剂量抑制的污染物作用效应在毒理学中广泛存在，所以污染物对生物的效应通常表现为一种“倒U”型曲线[16]。在该试验中也存在这种现象，这种低浓度草甘膦刺激铜绿微囊藻生长的现象需要引起重视，这在某种程度上更加促进了藻类的过量繁殖，加重了富营养化水体的危害程度。
（2）从铜綠微囊藻的抗氧化防御系统来看，CAT、POD和SOD酶的活性在所有草甘膦处理组几乎都被显著激活，这表明铜绿微囊藻确实可以利用抗氧化酶来抵御草甘膦所诱发的氧化损伤，但短期内这种防御系统的效果只局限于较低浓度的草甘膦。与空白相比，高浓度草甘膦处理组尽管酶活性很高，草甘膦仍然会诱发铜绿微囊藻藻密度下降和蛋白合成受阻等毒性效应。
（3）铜绿微囊藻细胞内外各种形态的磷代谢和转化随草甘膦浓度的变化差异明显。添加草甘膦后，细胞内外可直接利用的磷形态——正磷酸盐的含量和所占比例在低浓度组较大、高浓度组较小，可能直接造成了铜绿微囊藻的生长刺激或抑制效应。
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