摘要：测定湖北省不同地区水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感性，结果发现，抗性菌株的抗药性水平不高。根据常见植物病原真菌β-微管蛋白基因设计引物，从水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感和抗性菌株中扩增β-微管蛋白基因，均获得了大小为695 bp的基因片段，其中含有1个53 bp的内含子，与粗糙脉孢菌具有较高的同源性。序列分析结果表明，水稻纹枯病病菌抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位堿基发生了突变，分别由T、T、T突变为G、C、C，但这3个位点相对应的氨基酸却没有发生变化。此外，内含子的第15位碱基由G突变为A。由此可见，水稻纹枯病病菌对多菌灵抗药性的产生与β-微管蛋白基因的变异有一定的关系。
关键词：湖北省；水稻纹枯病病菌；β-微管蛋白；基因克隆；多菌灵抗药性；碱基突变
中图分类号： S4351114+2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0106-03
收稿日期：2016-06-14
基金项目：长江大学长江青年人才基金（编号：2015cqr18）；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心开放基金（编号：KF201410）。
作者简介：陈洪娜（1992—），女，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事微生物学研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：1242952938@qqcom。
通信作者：孙文秀，博士，副教授，主要从事植物病害的生物防治研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：wenxiusun@163com。
水稻是我国主要的粮食作物之一，在全球的粮食生产和供应中占有重要地位。在水稻生长和生产过程中，水稻纹枯病的发生严重影响了其质量和产量，给我国及世界各国的经济造成了巨大损失。水稻纹枯病由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）侵染引起，该病原菌寄主范围广、变异快、易产生抗药性。目前，主要采用化学药剂防治水稻纹枯病，却也导致了病原菌抗药性的产生并呈上升趋势。
苯并咪唑类杀菌剂能够通过与病原菌β-微管蛋白结合，影响微管的形成或使已形成的微管解聚，阻止细胞的有丝分裂1]，从而达到抑制病原菌的生长繁殖和侵入。但由于该类杀菌剂作用位点单一、选择性强，使得病原菌在药剂选择压力下易产生抗药性2]。其中，多菌灵是一种应用广泛的广谱性杀菌剂，对多种作物由真菌引起的病害具有良好的防治效果，但也产生了不同程度的抗药性。近年来研究发现，大多数植物病原菌抗多菌灵菌株的突变位点发生在β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸上3-5]，使氨基酸的三维结构发生了改变，降低了药剂的亲和力6]。但也有因为β-微管蛋白其他位点突变而引起病原菌抗多菌灵的研究报道7-12]。更有研究表明，β-微管蛋白不同氨基酸位点的突变可以引起病原菌对多菌灵敏感性的差异13]。目前尚未见到有关水稻纹枯病病菌对多菌灵抗药性的研究报道，本研究以筛选到的多菌灵敏感性和抗性菌株为试验材料，对β-微管蛋白基因进行克隆和测序，以明确β-微管蛋白是否发生基因突变，探索水稻纹枯病病菌对多菌灵产生抗药性的分子机制。
1材料与方法
11试验材料
111供试菌株
2014年从湖北武汉、荆州、宜昌等地区采集水稻纹枯病病株并进行分离纯化，共获得134株菌株。在含有10 μgmL多菌灵的PDA培养基（200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1 000 mL蒸馏水）上进行抗性和敏感性菌株的筛选，随机选取3株抗性菌株wkb2、wka3、wkd3和3株敏感性菌株wka2、wkb3、wkc1用于本研究。
112主要试剂
大肠杆菌感受态DH5α和pEASY-T1载体，均购自北京全式金生物技术有限公司；氨卡青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、dNTP、T4 DNA连接酶和Taq酶，均购自宝生物工程（大连）有限公司。
12试验方法
121药剂敏感性测定
将3个敏感菌株分别接种在含0、02、04、06、08、10 μgmL多菌灵的PDA培养基上，再将3个抗性菌株分别接种在含0、10、12、14、16、18 μgmL多菌灵的PDA培养基上，25 ℃条件下培养2 d，十字交叉法测量各菌落的直径。通过对菌丝生长抑制率和药剂的有效浓度对数值之间的线性回归分析，求出药剂的EC50，测定供试菌株对多菌灵的敏感性表型。
122基因组DNA的提取
将供试菌株菌块接种到PD液体培养基（200 g马铃薯、20 g葡萄糖、1 000 mL蒸馏水）中，25 ℃振荡培养，5 d后无菌过滤收集菌丝，冻干，液氮研磨。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
123PCR扩增及测序
根据已知植物病原真菌β-微管蛋白基因序列设计1对引物为Rs-F（3′-GTGAGTGAGAACJP3]CACCTCCA-5′）和Rs-R（3′-ACGTTGTTGG GGATCCACTC-5′），以供试菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物进行回收，与pEASY-T1载体连接，转化大肠杆菌 DH5α。在含Amp、X-gal、IPTG的LB平板（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl、15 g琼脂、1 000 mL 蒸馏水）上筛选白色菌落，提取质粒DNA进行PCR验证，阳性克隆送至济南博尚生物科技公司测序。
124序列分析
采用DNAclub软件分析序列，用DNAMAN软件进行序列同源性比较，比较水稻纹枯病病菌抗、感菌株β-微管蛋白基因片段的核苷酸和氨基酸序列，找出突变位点。
2结果与分析
21水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感性测定
测定从湖北省分离获得的水稻纹枯病病菌菌株对多菌灵的敏感性，发现2313%的菌株在含有10 μgmL多菌灵的PDA培养基上能够正常生长，表明产生了一定的抗药性14]。分别测定供试6个菌株对多菌灵的敏感性，结果如表1所示，敏感性菌株对多菌灵的EC50平均值为0301 2 μgmL，抗性菌株对多菌灵的EC50平均值为0613 4 μgmL，说明菌株的抗药性水平不高，多菌灵可以继续用来防治水稻纹枯病。
22序列分析
通过引物Rs-F和Rs-R对供试水稻纹枯病病菌的β-微管蛋白基因进行PCR扩增，测序结果表明，6个菌株均获得了同等大小的基因片段，片段长度为695 bp，其核苷酸序列与菌株AG-1-IA的β-微管蛋白基因同源性达999%。同时，通过与典型模式菌粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的β-微管蛋白基因比较发现，供试水稻纹枯病病菌β-微管蛋白基因片段均含有53 bp的内含子，其位置与粗糙脉孢菌的内含子6相似15]，可以明确该片段为β-微管蛋白基因。由图1可知，抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位碱基发生了突变，即敏感菌株中分别为T、T、T，抗性菌株中分别突变为G、C、C，且突变率为100%，但这3个位点相对应的氨基酸却没有发生变化。此外，内含子的第15位碱基由G突变为A。而报道较多的第198、第200位氨基酸并未发生突变。
FK（W20]TPCHN1tif；S+2mm]
3讨论与结论
大多数研究表明，植物病原真菌对多菌灵的抗药性与 β-微管蛋白基因变异有关，且由个别碱基突变导致氨基酸变异，从而产生抗药性。报道最多的是β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸发生突变。例如，粗糙脈孢菌（N crassa）抗性菌株中β-微管蛋白的第198位氨基酸由甘氨酸变成了谷氨酸，第200位氨基酸由苯丙氨酸变成了酪氨酸3]；油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）β-微管蛋白的第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸16]；胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第200位氨基酸由苯丙氨酸突变成了酪氨酸17]；小麦赤霉病病菌（Gibberella zeae）Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸变为酪氨酸，Js519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺18]等。除此之外，芒果炭疽病病菌（C gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第181、第237、第363位氨基酸发生了突变，而其他位置（如第198位或第200位）均不变19]。也有研究表明，一些植物病原真菌对多菌灵抗药性的产生与 β-微管蛋白基因无关，如水稻恶苗病病菌（Fusarium fujikuroi）20]、禾谷镰孢菌（F graminearum）21]等。
本研究通过测定水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感性发现抗药性水平不高，可以将多菌灵和井冈霉素交替使用来防治水稻纹枯病，防止抗药性的产生和提高。比较了抗、感菌株的β-微管蛋白基因序列，发现第271、第453、第612位碱基发生了突变，敏感菌株中分别为T、T、T，而抗性菌株中分别为G、C、C，但这3个位点碱基的突变却没有导致相应氨基酸发生变化。而且报道较多的第198、第200位氨基酸也未发生突变。此外，内含子的第15位碱基由G突变为A。这些突变均有可能导致水稻纹枯病病菌对多菌灵产生抗药性，也说明该病原菌对多菌灵产生抗药性的分子机制与其他真菌可能相同，但还有待于进一步确认这3个位点突变与多菌灵抗药性之间的关系。
上述研究结果表明，在对多菌灵产生抗药性的植物病原真菌中，β-微管蛋白基因的突变没有表现出一定的规律。本研究中水稻纹枯病病菌β-微管蛋白基因碱基的突变没有引起氨基酸的变化，可能与多菌灵的抗药性水平有一定的关系。此外，设计引物时主要考虑了第198、第200位的氨基酸位点，获得的β-微管蛋白基因没有包含全部突变位点，使本研究结果与以往报道不一致。为此，在本研究的基础上通过单核苷酸多态性（SNP）分子标记技术22]进一步分析水稻纹枯病病菌β-微管蛋白基因单个碱基的突变与多菌灵抗药性之间的关系，建立一种快速、准确、灵敏的检测抗性菌株和监测抗性群体发展动态的方法，这对于治理抗药性、延长药剂的使用寿命及降低生产成本等具有重要意义。
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