材料与方法
1.1 材料和仪器
3种人肝癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702均采购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，并按照其建议的方法进行培养。20%胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养液购自GIBCO公司，DEPC购自Sigma公司，ECL显色试剂盒购自Thermo-fisher公司，NC膜购自Amersham公司，引物、Rab27A兔多抗、Rab27B羊多抗、HRP标记驴抗兔IgG、β-actin购自生工生物工程公司，Trizol、Taq PCR试剂盒购自TaKara公司，PCR反应仪采用Thermocycler（Biometra Germany公司），Alphaimager 2200分析仪（Alpha Innotech，San Leandro，CA公司），其他常规化学试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 各种细胞均按照标准方法进行培养，传代时用2.5 g/L的胰蛋白酶消化， 按1∶3的比例传代。取生长状态良好、密度80%～90%的细胞用于实验。
1.2.2 RT-PCR Rab27A基因引物F：5′-AACCGCCACAGTCTTCAATC-3′，R：5′-TCCCTGACCCTTCAAT-CAAC-3′；Rab27B基因引物F：5′-CCCTAAAAATCCCAGTCCATC-3′，R：5′-GAGCATCCCAGAGGAAACAC-3′。反应过程如下：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃终延伸5 min，β-actin作为内参，扩增30个循环。PCR反应产物行1%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统分析结果。随后对细胞系中的Rab27A与Rab27B mRNA的表达水平进行全定量PCR。
1.2.3 Western blot SDS-PAGE分离蛋白，每个样品的上样量为50 μg，电转至NC膜。5%脱脂牛奶4℃封闭1 h，孵育一抗Rab27A（1∶1000稀释）或Rab27B（1∶1200稀释），4℃过夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10 min。加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液（1∶10 000稀释），摇床上缓慢摇动，37℃ 2 h。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10 min。最后采用ECL试剂盒显影，定影，观察杂交信号。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
通过采用RT-PCR、Western blot分析了3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中Rab27A及Rab27B mRNA及蛋白表达情况。β-actin内参条带在205 bp处皆显现明亮且无明显差异，Rab27A mRNA在357 bp处3种人肝癌细胞系中明显亮于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在302 bp处均出现目的条带，且条带清晰；实验重复3次。结果表明Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差异（图1）。其中，β-actin作为内参。
A
3 讨论
HCC是一种严重威胁人类生命的恶性肿瘤，发生率位居全球恶性肿瘤发病率第5位，死亡率位居全球恶性肿瘤发病率第3位，全球每年死于HCC患者人数高达69.6万，其中超过50%的肝癌新发患者与死亡患者来自中国[1-2]。HCC的侵袭和转移过程涉及到肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等过程，而这一过程正是通过多种因子间的相互协调来实现。2013年诺贝尔生理学和医学奖表彰詹姆斯·罗思曼等人发现细胞的囊泡运输调控机制，表明细胞膜的分裂与囊泡运输时细胞膜裂解是一致的。细胞的生命活动依赖于细胞内运输体系的精细结构和控制结构，通过与目标细胞膜融合，在神经细胞指令下可精确控制激素、生物酶、神经递质等分子传递的恰当时间与位置。RabGTP酶类作为机体内一组与内膜运输相关的调节蛋白，可以作为囊泡运输的分子开关，与GTP结合则有活性，与GDP结合则无活性，通过与上游调控因子和下游特异效应因子相互作用，影响细胞的分泌、胞吞、信号转导及发育，并可以控制膜结构的一致性和囊泡的形成、转运、黏附、锚定、融合等过程，从而发挥重要的作用[3-4]。
人类Rab蛋白广泛分布于各种生物细胞内不同的膜结构上，是小分子GTP结合蛋白家族中最大的亚家族，包括超过60个成员组成，可以通过不同的可变剪切形式而产生各种功能特异的亚型[5-6]。Rab家族可以通过特异性地定位于胞质中某些亚细胞器从而发挥特殊的功能，而抑制其中一些蛋白的表达，细胞膜的裂解次数可明显减少[7]。Rab27亚家族包括Rab27A与Rab27B，两者是具有71%同源性的小GTP 酶（20～29 kD），可以通过影响囊泡运输物质来抑制机体免疫监视功能，并为肿瘤细胞提供理想的生存环境，促进血管生成及肿瘤细胞增殖转移[8]。Rab27A在人类染色体位点15q15-21.1，调节因子有3种：Rab亲和蛋白，Slac2和Muncl3-4，功能主要为特异性地调节囊泡出胞过程，促进囊泡与细胞膜融合，并且激活溶酶体，促进细胞膜裂解[9]。Rab27A参与细胞色素颗粒的转运，若表达缺失会导致色素沉着消失和黑素小体转运功能缺陷，从而导致一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病——格里塞利综合征（GS）[10-11]。Rab27A通过与Melanophilin和肌浆球蛋白Ⅴa共同形成一个三元复合体，参与粗细肌丝的滑行运动，因此有学者认为Rab27A具有肌球蛋白受体的全部或部分功能[12]。研究表明Rab27A可以通过调节VEGF、cyclin D1、IGF-2、MMP-9、MMP-7和p16蛋白的表达，从而在肿瘤细胞体内增殖、侵袭和转移中发挥促进作用[13]。Rab27B位于18号染色体上，调节因子有3种：突出结合蛋白4（Slp4），Slac2b和Noc2，功能主要为参与大多数分泌性细胞的胞吐作用及运输过程，促进囊泡物质由细胞质向细胞膜区域运动，在脑垂体、腮腺腺泡细胞、胰腺腺泡细胞的胞吐作用及血小板致密核心颗粒的分泌中有重要的调节作用[14-16]。有研究表明，抑制uPA和HGF的胞外水平的表达，HCC的侵袭和转移能力均显著下降。
近来研究发现，Rab27A与乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、神经胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关；Rab27B表达于乳腺、肝脏、胃、大肠、脾、眼、心脏、肾脏等多种肿瘤细胞[16-20]。本实验采用RT-PCR及Western blot技术，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达，笔者发现，Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中存在差异性表达，Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差别。因此，根据上述实验结果，Rab27A与Rab27B与HCC密切相关，可以为临床采取合理诊断措施提供有效的参考依据。
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（收稿日期：2015-01-30 本文编辑：卫 轲）