【摘要】 目的：研究肿瘤源性IgG在人肝细胞肝癌中的表达和分布情况及其与临床病理学指标的关系。方法：分别应用免疫组化二步法和原位杂交检测60例肝细胞肝癌组织及其周围正常肝组织中IgG蛋白和IgG mRNA的表达，分析IgG的表达水平与9项肝细胞肝癌的临床病理学指标之间的关系。结果：肝癌组织中IgG的表达明显高于其周围正常肝组织，且两者表达程度比较差异有统计学意义（P=0.001）；IgG在肿瘤组织中的异常高表达与肿瘤分化程度和pTNM分期呈负相关（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021），与血浆AFP浓度呈正相关（r=0.336，P=0.009），与年龄、性别、肿瘤包膜的完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发或转移无相关性（P>0.05）。结论：肝癌细胞所产生的IgG与肿瘤的分化、pTMN分期相关，可能作为辅助肝细胞肝癌病理学诊断和预后评估的一项重要指标。
【关键词】 IgG； 肝癌； 临床病理学指标； 原位杂交； 免疫组织化学
【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.
【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry
First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008
近来多项研究证明，乳腺癌、大肠癌、胃癌和肺癌等源于上皮的恶性肿瘤细胞可以产生IgG[1-6]。邱晓彦等[4]最早发现Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤的分化有关；依据肿瘤的分化程度不同，Ig样蛋白的表达水平也不同，即分化程度越高，表达强度越低，并证实该Ig样蛋白为IgG；叶雪等[7]发现在恶性卵巢上皮性癌中IgG的表达强度明显高于正常卵巢，IgG的表达水平与卵巢癌的临床分期和病理分级无相关性；李浩勇等[6]对膀胱癌研究发现：膀胱癌细胞能够表达IgG，其抗体体外对膀胱肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用，且具有促进癌细胞凋亡的效应；Niu等[8]研究了IgG的表达与结直肠癌的生物学指标和临床病理学指标的关系，通过siRNA干扰下调IgG的表达，可以抑制结直肠癌细胞（LOVO细胞）的增殖、克隆形成和侵袭能力，提示肿瘤源性IgG具有促进肿瘤生长，转移的作用。肝癌亦属于上皮性恶性肿瘤，但是目前对于IgG在肝癌组织中的表达与分布情况及其与临床病理学指标的关系的研究尚未有报道。本实验采用免疫组化技术和原位杂交技术检测肝癌组织中IgG的表达情况，进而分析其表达水平和肝细胞肝癌9项临床病理学指标的关系，以期为肝细胞肝癌的诊断、治疗和预后评估提供新的方法和思路。
1 材料与方法
1.1 材料来源 收集潍坊医学院附属医院和潍坊市民医院2010-2012年手术切除的肝癌标本60例，其中男40例，女20例，平均年龄45岁，患者术前均未采取任何治疗措施。所有肝癌病例随访12～18个月。本实验经潍坊医学院伦理委员会批准，并获得患者的书面许可。所有新鲜标本均经4%多聚甲醛/PBS固定，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。
1.2 免疫组化方法 采用PV-9000两步法（试剂盒购自美国Zymed公司）进行免疫组化检测。切片常规脱蜡，入水，枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，经3%过氧化氢37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG单克隆抗体（1：1000，购自美国sigma公司），4 ℃湿盒过夜，滴加试剂1（聚合物辅助剂），37 ℃孵育30 min，滴加试剂2（辣根过氧化素）标记二抗，37 ℃孵育30 min。各步骤之间均是PBS冲洗3次，每次5 min。AEC显色，苏木素复染，甘油明胶封片。以手术切除的扁桃体组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 原位杂交方法 切片二甲苯脱蜡，乙醇梯度透明至PBS反复冲洗，酶消化，经预杂交，滴 50μL含探针的杂交液，45 ℃保温，20 h。将切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次经5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL马血清封闭液，置湿暗盒中室温1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，购自瑞士roche公司），室温1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗数次，NBT-BCIP显色。以结肠黏膜下孤立淋巴结作为阳性对照，以IgG正义探针代替反义探针作为阴性对照。
1.4 免疫组织化学结果评分 采用双盲法，由3位病理学教授在400×的显微放大倍数下随机对染色切片独立评分，所得平均分作为最终结果。评分标准如下：（1）阳性细胞数所占比例：小于5%为0，5%～25%为1，25%～50%为2，大于50%为3；（2）染色强度：未着色为0，淡红色或粉红色为1，红色为2，深红色为3。两项测量标准得分之和为0～3分的切片标记为弱染色，阴性；4～6分的切片标记为强染色，阳性。
1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理，计数资料比较采用Pearson 字2及Fisher确切概率法检验分析，评估IgG的表达情况与临床病理学参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤分化程度、AFP浓度、pTNM分期、1年内是否复发或转移）之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IgG蛋白在肝癌组织的表达及免疫组化检测结果 经免疫组化检测结果显示60例肝癌组织的IgG蛋白阳性率为85.00%（51/60），癌周正常肝组织的阳性率为6.67%（4/60），两者比较差异有统计学意义（P=0.001）。IgG蛋白阳性染色主要定位于肝癌细胞胞浆和胞膜。
2.2 IgG mRNA在肝癌组织的表达及原位杂交结果 IgG mRNA阳性信号位于肝细胞肝癌细胞胞浆，为蓝紫色，呈颗粒状，与免疫组化结果具有良好的一致性，从mRNA水平证实了肝细胞肝癌组织自身具有产生IgG的能力。
2.3 IgG在肝癌组织中的表达和临床病理学指标的关系 IgG的异常高表达与肝细胞肝癌分化程度和pTNM分期呈负相关（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；与血浆AFP浓度呈正相关（r=0.336，P=0.009）；与年龄、性别、肿瘤包膜完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发与转移无相关性（P>0.05），见表1。
3 讨论
免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是体内免疫球蛋白家族中含量最高的一种，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。经典免疫学理论认为IgG仅可由B淋巴细胞经成熟分化过程才能够特异性合成并分泌。近年来多项研究发现IgG在其他多种上皮性恶性肿瘤组织和细胞系中也存在异常高表达的现象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近发现IgG在结直肠癌组织中和CRC细胞中高度表达，而且此高度表达与肿瘤的分期、淋巴结转移和炎性细胞浸润有密切的关系，提示肿瘤源性IgG可能对肿瘤的发生发展有重要影响。有研究显示在肝细胞肝癌患者的血浆中和肝癌细胞系（BCL-7402）中均可检测到IgG的含量异常增高[2，5，9]。但是在肝癌组织中的表达情况未有报道，肝癌细胞所分泌的IgG的功能未知，其表达和癌症的临床病理学指标的关系也有待于研究。
在本项研究中，笔者分别从蛋白质水平和mRNA水平证明了肝癌组织可以产生IgG。IgG在肝癌中的高表达（85.00%）与肿瘤的分化程度和pTNM分期呈负相关，IgG在分化较差（低分化或未分化）或在处于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝细胞肝癌组织中的表达比在分化较好（中分化或高分化）或在处于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝细胞肝癌组织中更为明显；IgG的高表达与血浆AFP浓度呈正相关，与年龄、性别、肿瘤包膜的完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发或转移无相关性。实验结果提示肿瘤源性IgG可能与肿瘤生长有关。免疫球蛋白能促进肿瘤生长的现象已有报道，这主要与“抗癌抗体”阻断癌细胞表面的靶表位有关[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中发现异常糖基化的免疫球蛋白分子不能诱导免疫应答。此外，免疫球蛋白重链，T淋巴细胞受体（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白样黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌细胞中表达[15]。免疫球蛋白抗体和T淋巴细胞受体可启动补体依赖的细胞毒作用，致使癌细胞凋亡。所以免疫蛋白超家族对于肿瘤细胞可能具有自身保护作用，并与癌细胞的增殖有关。邱晓彦等[4]早期研究了3例肝癌组织，其分化程度均为中度，研究结果显示肝癌细胞中Ig蛋白均具有很高的表达量，因此认为在肝癌组织中IgG的表达程度与肿瘤的分化无相关性。而本研究提示IgG在肝癌中的异常表达与肿瘤的分化程度呈负相关。这种差异可能由于样本量大小不同造成。
甲胎蛋白（AFP）是分子量为64 000～70 000道尔顿的一种糖蛋白，主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成，是胎儿成长发育的重要蛋白，具有保护胚胎不受母体排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出现则提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌诊断、治疗和预后判断的重要指标。贾户亮等[16]分析肿瘤数目、大小和pTNM分期不同的肝细胞肝癌的患者血清AFP水平显示，AFP水平的高低与肿瘤的大小、数目和pTNM分期均呈正相关，其中pTNM Ⅰ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝细胞肝癌患者血清AFP水平具有显著的差异。
本实验结果表明，血清AFP水平较高（>400 μg/L）
的肝细胞肝癌患者组的IgG阳性表达率（92.8%，39/42），比血清AFP水平较低（≤400 μg/L）的肝细胞肝癌患者（66.7%，12/18）组显著增高，与先前文献报道结果一致。尽管血清AFP含量水平对肝癌的早期诊断有重要意义，但是并非所有AFP升高都可以断定为肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活动灶等疾病中亦可检测到高水平含量的血清AFP，因此仅仅根据血清AFP浓度来对肝细胞肝癌进行早期诊断是不够准确的[17-18]。所以联合肿瘤源性IgG表达水平的检测可提高阳性检出率，降低漏诊率和误诊。
综上所述，在肝癌组织中IgG表达显著增高，IgG的表达水平与肿瘤的分化、分期有着密切的关系。这可为以后的肝癌的早期诊断和分期判断提供了又一重要指标。研究IgG的表达与肿瘤的生长分化的关系，有助于为肿瘤的免疫治疗提供理想的理论依据，但是对于其功能与分子机制的关系有待于进一步研究。
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（收稿日期：2014-03-18） （本文编辑：蔡元元）