摘要：目的 观察加味四君子汤对腹泻型肠易激综合征（IBS-D）中医辨证为脾虚者结肠黏膜中5-羟色胺（5-HT）受体mRNA表达水平的影响，探讨其作用机制。方法 将39例脾虚型IBS-D患者随机分为治疗组和对照组，另以健康志愿者为正常组。治疗组给予加味四君子汤口服，对照组给予马来酸曲美布汀口服，疗程均为 4 周。观察治疗前后患者症状积分的改变。对脾虚型IBS-D患者和正常组在治疗前后行结肠镜检查并取结肠黏膜标本4块，用实时荧光定量聚合酶链反应检测5-HT3和5-HT4受体mRNA的表达水平。结果 治疗组患者的总有效例数高于对照组。治疗前治疗组及对照组5-HT3和5-HT4受体mRNA在结肠黏膜的表达显著升高（P<0.01）；治疗后2组的5-HT3和5-HT4受体mRNA在结肠黏膜的表达显著降低（P<0.01或P<0.05），与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 加味四君子汤可改善脾虚型IBS-D患者的主要症状，疗效优于马来酸曲美布汀，改善结肠黏膜5-HT3和5-HT4受体表达异常可能是其机制之一。
关键词：加味四君子汤；腹泻型肠易激综合征；5-羟色胺3；5-羟色胺4；荧光定量PCR
中图分类号：R259.744 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0019-03
肠易激综合征（IBS）是一种常见的胃肠功能性疾病，有腹
基金项目：国家自然科学基金（30973926）；广州中医药大学创新基金（10CX082）
通讯作者：周福生，E-mail：zhoufusheng123@yahoo.com.cn
痛、腹胀伴排便习惯改变、粪便性状异常等临床表现。研究显示，IBS患者存在5-羟色胺（5-HT）分泌的异常，5-HT参与了IBS的主要生理病理过程[1-2]。5-HT通过与不同器官上的膜受体结合而发挥作用，其中胃肠道中主要存在5-HT3、5-HT4两种类型，5-HT可通过与这两种受体结合而影响和调节IBS患者的胃肠运动、分泌、吸收及感觉等功能[3]，故5-HT及其受体与IBS患者腹痛、腹泻和内脏感觉异常等症状密切相关。研究表明，中医药对IBS具有较好的疗效[4]，但其诊治IBS病理生理学机制目前尚不明确。因此，本研究采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测腹泻型肠易激综合征（IBS-D）中医辨证属脾虚的患者在加味四君子汤治疗前后5-HT3、5-HT4受体在结肠黏膜的基因表达水平，探讨加味四君子汤对脾虚型IBS-D的干预机制。
1 资料与方法
1.1 诊断与纳入标准
符合IBS-D诊断标准（罗马Ⅲ标准）[5]和中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会制定的“肠易激综合征中西医结合诊治方案（草案）”中脾虚型IBS-D中医诊断标准[6]。
1.2 排除标准
①年龄在18岁以下或65岁以上；②肠道器质性疾病，如炎症性肠病、肠结核、结肠息肉；③严重的心脑血管系统、肝、肾、造血系统疾病以及肿瘤等患者；④应用可能影响胃肠道功能药物的患者；⑤未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效或安全性判断者。
1.3 一般资料
根据上述标准选择2011年6月-2012年3月期间广州中医药大学第一附属医院门诊及住院患者，按照随机、对照的原则，采用随机数表法进行分组。最终完成疗程的合格病例共39例。治疗组20例，男8例，女12例，平均年龄（43.2±18.3）岁，平均病程（2.87±1.26）年；对照组19例，男9例，女10例，年龄（42.1±17.5）岁，平均病程（2.63±1.19）年。2组患者性别、年龄、病程等临床资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。治疗组完成疗程后再次经结肠镜取标本的病例共11例，对照组完成疗程后再次结肠镜取标本的病例9例。另选门诊体检的健康志愿者为正常组，收集结肠黏膜标本共10例。
1.4 治疗方法
治疗组给予加味四君子汤剂（党参20 g，白术15 g，茯苓15 g，甘草6 g，黄芪20 g，广州中医药大学第一附属医院制剂室制成200 mL/袋）口服，1袋/次，2次/d，4周为1个疗程。对照组给予马来酸曲美布汀片（商品名：援生力维，开开援生制药股份有限公司生产，国药准字H20000388）口服，每次0.1 g， 3次/d，4周为1个疗程。
1.5 疗效观察
参照IBS罗马Ⅲ标准所说明的临床症状[5]，并结合“肠易激综合征中西医结合诊治方案（草案）”的主要症状分级及评分标准[6]，对脾虚型IBS-D患者治疗前后的症状进行评分并累加，采用尼莫地平法评估临床疗效。
1.6 荧光定量PCR法检测5-羟色胺受体mRNA表达水平
1.6.1 样本收集与处理 经结肠镜在肠道结肠回盲部取结肠和乙状结肠黏膜标本各2块，放入消毒冻存管液氮速冻后转至-80 ℃低温冰箱储存备用。
1.6.2 试剂与仪器 RT-PCR试剂盒为大连宝生物有限公司生产，琼脂糖、EB替代品、溴酚兰等为进口分装，氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司），PE-9600基因扩增仪（美国ABI公司），PAC3000型电泳仪（Bio Rad）。5-HT3、5-HT4和内参对照β-actin的引物合成由大连宝生物工程有限公司完成。
1.6.3 检测方法 ① RNA抽提和质量检测：按照广州中医药大学第一附属医院临床分子生物实验室总RNA提取SOP提取肠黏膜中的总RNA，所得总RNA在紫外分光光度计上检测吸光度（OD）值，以OD260和OD280 获取样品中RNA纯度和含量（µg/mL），并根据RNA纯度计算出RT-PCR所需总RNA的用量。②运用引物设计软件Primer3设计5-HT3、5-HT4和内参β-actin的引物。5-HT3的Forward Primer：5"-CAAGCCACCAAGACTGATGA-3"；Reverse Primer：5"-A ACCAGGGTGATGCTGTAGG-3"；扩增片段长度为297 bp。5-HT4的Forward Primer：5"-CTCTGGACGTCC TGCTCACAA-3"；Reverse Primer：5"-CTGGCAGCAGATGGCGTAA- 3"；扩增片段长度为83 bp。β-actin的Forward Primer：5"-CAAATGCTTCTAGGCGGACTATG-3"；Reverse Primer：5"-AAG GGACTTCCTGTAACAACGCA-3"；扩增片段长度为299 bp。运用BLAST软件对引物进行特异性验证。③反转录：采用大连宝生物工程有限公司的RT reagent Kit试剂盒进行反转录，操作均在冰上完成。反转录反应体系：5×PrimeScript® Buffer（for Real Time）2 µL，PrimeScript® RT Enzyme Mix I 0.5 µL，Oligo dT Primer（50 µmol/L）0.5 µL， Random 6 mers（100 µmol/L） 0.5 µL，添加RNase Free dH2O直至10 µL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。④PCR扩增和检测：在ABI7500定量扩增仪上进行实时荧光定量PCR扩增和检测。定量PCR反应体系：Premix Ex Taq酶25.0 µL，PCR Forward Primer（10 μmol/L） 1.0 μL，PCR Reverse Primer （10 μmol/L） 1.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 1.0 μL，DNA模板4.0 μL，dH2O 18.0 µL，合计50 µL。反应条件：95 ℃预变性5 s，62 ℃ 30 s，40个循环。40个循环后行溶解曲线步骤，通过PCR分析软件对 RT-PCR的结果进行实时定量分析，5-HT3、5-HT4的相对表达量采用2-△△Ct计算，Ct值为目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。最终扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无非特异性扩增及扩增片段长度。
1.7 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析，数据以—x±s表示，组间比较采用t检验，检验水平α=0.05。
2 结果
2.1 临床疗效
加味四君子汤可改善脾虚型IBS-D患者的主要症状，如腹痛、腹胀、便溏、大便不尽感等。治疗组痊愈3例，显效10例，好转4例，无效3例；对照组痊愈2例，显效9例，好转3例，无效5例。治疗组的总有效例数高于对照组。
2.2 肠黏膜5-羟色胺受体mRNA表达
在β-actin扩增效率一致的情况下，治疗前治疗组及对照组的5-HT3和5-HT4受体mRNA在结肠黏膜的表达显著升高（P<0.01）；治疗后2组的5-HT3和5-HT4受体mRNA在结肠黏膜的表达显著降低（P<0.01或P<0.05），与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 讨论
脾的主要生理功能及病理表现与现代医学消化系统关系密切。中医学认为，脾主运化、主升清、主统血，其中脾主运化为脾的最主要的功能，脾虚证也主要表现为脾失健运。脾虚时脾失健运，则机体的消化、吸收、运输等功能减退。IBS是由多种病因引起的以结肠动力学紊乱及内脏敏感性增高为基本病理表现的功能性疾病。5-HT是一种重要的胃肠激素，调控着消化道的分泌、运动、吸收及细胞营养等功能，其分泌异常必然会影响消化道的功能，引起各种临床症状。有研究发现，肠道黏膜在受刺激时可引起5-HT释放，作用于肠黏膜上的5-HT受体而发生作用[7]。其中5-HT3、5-HT4两种受体与胃肠道生理功能的关系最为密切。IBS-D发生时，5-HT增多，与外源性初级传入神经元神经末梢的5-HT3受体结合，导致内脏传入神经及肠神经系统高敏感，从而引起疼痛、不适等感受及一系列反射活动。5-HT通过激活5-HT3受体或5-HT4受体可增加胃肠道收缩，提高胃肠道的传输速度。5-HT3受体有促进肠道动力的作用，分布于肠肌神经元的5-HT3受体可介导5-HT能中间神经元突触的快兴奋性神经传递，使胆碱能神经元释放乙酰胆碱增加，致使结肠传输时间缩短，大便次数增加。5-HT引起的结肠液体分泌主要受5-HT3和5-HT4受体的调节[8]。神经性通路主要由5-HT3受体调节，而非神经通路主要由5-HT4受体调节[9]。5-HT可促进氯离子从结肠细胞的外流，存在于肠细胞上的5-HT4受体被激活后，通过和G蛋白结合来介导环磷酸腺苷的生成，继而激活囊性纤维化跨膜传导调节因子，使氯离子分泌增加，从而使IBS患者出现大便稀烂的症状。
中医治疗的根本目的是从整体上对机体的功能状态进行调节。四君子汤是中医健脾益气的经典方。本研究发现，脾虚型IBS-D患者的主要症状，如腹痛、腹胀、便溏、大便不尽感等与结肠黏膜5-HT3、5-HT4受体mRNA的表达水平有关，随着加味四君子汤的应用，脾虚型IBS-D主要症状改善的同时，结肠黏膜5-HT3和5-HT4受体表达明显下降，与正常组相比差异无统计学意义。一方面，从胃肠道5-HT及其受体与脾虚证的关系验证了加味四君子汤的健脾益气、改善消化系统功能的作用；另一方面也表明，结肠黏膜5-HT3和5-HT4受体mRNA 表达异常可能是脾虚型IBS-D临床表现的致病机制之一，加味四君子汤可能通过作用于胃肠道5-HT及其受体而改善患者的临床症状。
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（收稿日期：2012-06-25，编辑：陈静）