摘要 [目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体，并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因，通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段，将其连入通用植物表达载体 pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPTII和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300PhDFRGFP和pCAMBIA3301PhDFRGFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达载体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础，为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达载体。
关键词 DFR基因；植物表达载体；烟草遗传转化；Bar
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05380-05
Abstract [Objective] The aim was to construct a plant expression vector carrying Petunias PhDFR gene and to genetically transform it into tobacco. [Method] Two PhDFR gene was cloned from Petunia varieties with different flower color in the previous study. Through multi technical methods including sequence cloning of target genes， double enzyme digestion， plasmid vector connection and transformation， target gene PhDFR were introduced into the plant expression vector pCAMBIA2300 and pCAMBIA3301. These vectors were genetically transform into Agrobacterium tumefactions strain GV3101 and then applied in genetic transformation of tobacco recipient plants.
[Result] The plant overexpression vectors carrying target genes PhDFR， including pCAMBIA2300PhDFRGFP which contained kanamycin resistance selection marker gene NPTII and GFPfused gene， and pCAMBIA3301PhDFRGFP which contained Basta resistance marker gene Bar and GFPfused gene， were successfully constructed. The correctness and practicability of expression vector construct were further verified by GUS staining analysis of transgenic plants further. [Conclusion] The constructed plant overexpression vectors provide a foundation for further study on the function of PhDFR genes in regulating plant flower color and genetic engineering related to modification of plant flower color. This study also provided excellent alternative plant expression vectors for plant genetic engineering work.
Key words DFR gene； Plant expression vector； Tobacco genetic transformation； Bar
自然界中的花色素主要有3大类群：类黄酮类、类胡萝卜素类和生物碱类[1]，而类黄酮类色素中的花色素苷（anthocyanin）是影响花色的主要色素，控制着花的粉红色、红色、紫罗兰色和蓝色[2]。植物花青素合成途径已经为人们所熟悉，类黄酮生物合成途径中花色素苷形成如图1所示。
花青素合成大致可以分为3个阶段[3-6]，第1阶段由苯丙氨酸到 4-香豆酰CoA，这是苯丙烷类次生代谢途径所共有的；第2阶段是类黄酮代谢的关键反应，由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢堪非醇，该阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇在不同酶作用下，可转化为花青素和其他类黄酮物质；第3阶段由二氢黄酮醇到各种花青素的合成，其中有关的酶如类黄酮 3′羟化酶、类黄酮 3′，5′羟化酶、二氢黄酮醇还原酶，花青素合成酶ANS和类黄酮 3葡糖基转移酶3GT，在这个过程中，花色素经过各种甲基化、糖基化、羟基化等等反应，最终形成了稳定的花色素苷，各种不同的花色素苷的比例最终决定了植物的外观颜色。
在花色素苷合成途径中，从第2到第3阶段的转变中，由第2阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇，可以在不同的酶作用下，或者进入花青素合成途径，或者合成其他类黄酮物质，此过程中二氢黄酮醇还原酶（DFR）在花色素苷合成途径中起着关键的作用，由DFR作用得到的产物，将作为后续合成花色素苷的底物，从而最终形成各种稳定的花色素苷。DFR的氨基酸序列决定了其底物的种类，不同物种中 DFR 与底物的结合区域是高度保守的，其中第 134位氨基酸残基直接决定底物的特异性[7]。由于不同物种的DFR 对底物选择性不同，所以合成不同的花色素，呈现的花色各异[8]。
实验室在前期研究中，从不同花色（红色及蓝色）矮牵牛（Petunia hybrid）品种材料中克隆到了2个序列有所差异的PhDFR基因，为了进一步研究PhDFR基因在类黄酮/花色苷生物合成中的作用及不同DFR基因对植物花色性状的影响，笔者分别构建卡那霉素及除草剂BASTA筛选标记的PhDFR基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合的植物表达载体，对烟草进行遗传转化，验证其功能，以期为植物花色改良相关基因工程提供候选基因及备选植物表达载体。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1）种子，为中国科学院新疆理化技术研究所植物资源化学研究室保存。
1.1.2 菌株和质粒。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α、 根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株GV3101及植物表达载体pCAMBIA2300OCS、pCAMBIA3301OCS，均为实验室保存；含有外源基因FT与绿色荧光蛋白GFP融合的双元质粒载体pCAMBIA2300FTGFP，由石河子大学生命科学学院黄先忠老师赠与。克隆载体TVector pMD19 Simple，购自大连宝生物公司；目的基因PhDFR2（克隆自红色矮牵牛品种，GenBank登录号：KC46484）及PhDFR3（克隆自蓝色矮牵牛品种，GenBank登录号：KC464485）保存于克隆载体pGEMPhDFR2和pGEMPhDFR3中。
1.1.3 主要试剂。PCR所用的酶Es Taq DNA Polymerase及buffer，购自康为世纪；连接酶T4 DNA Ligase、Xgal、IPTG、λDNA /EcoRI+Hind Ⅲ Marker和DL2000Marker，购自宝生物（大连）公司；限制性内切酶选用Thermo Scientific Fast Digest，购自美国Thermo公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；测序及引物合成，均委托上海生工生化试剂有限公司；BAR基因筛选剂Basta（活性成分为草丁膦PPT，Phosphinothricin）、氨苄青霉素（Ampicillin）及卡那霉素（kanamycin），购自Sigma公司；6苄基腺嘌呤（6BA）、吲哚乙酸（IAA）以及细菌培养基为进口分装，其他相关试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 方法
1.2.1 目的基因序列的克隆。利用实验室已经保存的PGEMPhDFR2和PGEMPhDFR3载体为模板（已测序），因为2个DFR基因的编码区两侧碱基序列完全一致，设计带KpnIXbalI酶切位点的引物PhDFRF： GGTACC ATGGCAAGTGAAGCAGTTC和PhDFRR： TCTAGAG ACTTCAACATTGCTTAACATT，用PCR制备带有酶切位点目的基因编码区的插入片段，选用20 μl的PCR体系，包括10×PCR buffer 2 μl，dNTPs （10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Es taq DNA Polymerase（5 U/μl）0.2 μl，模板质粒0.5 μl，ddH2O 14.8 μl。扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，75 s；35个循环；72 ℃延伸 5 min。PCR 产物在琼脂糖凝胶（1.0%）中电泳检测并回收，并连接到TVector PMD19 simple载体中，转化大肠杆菌 DH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白斑，使用菌落PCR验证后送公司进行测序，含有目的基因的新载体命名为 pMD19PhDFR2和pMD19PhDFR3。
1.2.2 表达载体pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFP的构建。用Kpn1Xbal1酶切体系对pMD19PhDFR2、pMD19PhDFR3、pCAMBIA2300FTGFP载体进行双酶切，然后电泳、回收目的基因片段及载体骨架片段，用T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素筛选阳性克隆，使用菌落PCR和质粒酶切验证确定正确的重组子，构建的重组质粒命名为pCAMBIA2300PhDFR2GFP和pCAMBIA2300PhDFR3GFP。
1.2.3 表达载体pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP的构建。对pCAMBIA3301 OCS和2300PhDFR3GFP进行EcoRIPstI双酶切，电泳并回收pCAMBIA3301骨架部分及PhDFR3载体小片段（含目的基因表达盒），连接转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素筛选阳性克隆，并提取质粒进行酶切验证，构建的重组质粒命名为pCAMBIA3301PhDFR3GFP。
对已经构建好的pCAMBIA3301PhDFR3GFP和pCAMBIA2300PhDFR2GFP进行EcoRIXbaI的双酶切，电泳并回收pCAMBIA3301PhDFR3GFP大片段及PhDFR2载体小片段，连接转化大肠杆菌，对阳性克隆提取质粒进行酶切验证，构建的重组质粒命名为pCAMBIA3301PhDFR2GFP。
1.2.4 重组质粒转化根癌农杆菌。利用冻融法将重组质粒pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301 PhDFR3GFP转化到农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株GV3101[9]，阳性克隆经过PCR验证后长期保存。
1.2.5 表达载体对烟草的遗传转化及转基因植株鉴定。烟草的遗传转化及转基因植株中报告基因GUS的分析检测，参照文献[10]进行。不定芽诱导和选择培养基为 MS基本培养基附加2 mg/L 6BA+0.1 mg/L NAA+10 mg/L Basta+400 mg/L羧苄青霉素+3%蔗糖+7 g/L琼脂。生根培养基为MS基本培养基附加15 mg/L Basta+400 mg/L羧苄青霉素+3%蔗糖+7 g/L琼脂。GUS基因检测，分别从具有Basta抗性的完整再生植株和野生型烟草植株上（阴性对照）取下叶片切割成约0.5 cm×0.5 cm大小，置于装有GUS（含XGluc）染液的离心管中，置于37 ℃培养箱中过夜，然后用95%乙醇脱色（除去叶绿素）直至阴性对照材料为无色为止。
2 结果与分析
2.1 目的基因序列的克隆 利用带Kpn1Xbal酶切位点的引物，从实验室保存的PGEMPhDFR2和PGEMPhDFR3载体PCR扩增处带有酶切位点的PhDFR2和PhDFR3目的基因片段（图2A），电泳结果显示，扩增片段大小接近1 200 bp，与预期一致。插入片段经凝胶回收，连接至PMD19T载体，双向测序及双酶切验证结果表明转化、连接正确，克隆载体pMD19PhDFR2和pMD19PhDFR3构建成功。
2.3 表达载体pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301PhDFR3GFP的构建及其验证 含有Bar基因植物表达载体的构建利用本实验室已构建保存的pCAMBIA3301OCS进行。首先，将pCAMBIA2300PhDFR3GFP进行EcoR1PstI双酶切，然后回收小片段的PhDFR3目的基因表达盒以及pCAMBIA3301的骨架部分，连接转化后，用双酶切方法对重组子进行验证，结果与预期相符，证明已经成功地将PhDFR3基因表达盒引入pCAMBIA3301载体，成功构建了含有BAR、pDFR3GFP的植物表达载体pCAMBIA3301PhDFR3GFP（图5B）。
由于PhDFR2基因内部含有Pst1位点，不能直接使用EcoRIPstI双酶切的方法构建Bar基因表达载体，因此利用EcoRIXbaI双酶切将pCAMBIA2300PhDFR2GFP中的PhDFR2目的基因片段引入pCAMBIA3301PhDFR3GFP，成功构建了pCAMBIA3301PhDFR2GFP植物表达载体（图5A）。
2.4 烟草转基因植株的获得及GUS检测 将构建成功的pCAMBIA3301PhDFR2GFP和pCAMBIA3301 PhDFR3GFP重组表达载体转化根癌农杆菌GV3101，PCR验证后，进行烟草遗传转化。经过筛选获得了具有Basta抗性的再生植株（图6）。对于Basta筛选条件下生根良好、叶色及形态正常的再生植株进行GUS染色。结果显示，野生型叶片呈现白色，无本底水平的GUS活性，推测的转基因植株的叶片，经过GUS染色、酒精洗脱，呈现出明显的蓝色结果。结果表明，表达载体中的TDNA区整合到了烟草基因组中，同时所带筛选标记基因GUS正常表达，表达载体构建正确。对目的基因及GFP报告基因的表达检测以及功能分析正在进一步试验研究中。
3 结论与讨论
花色素苷是影响植物花色的主要色素之一，其生物合成途径属于苯丙烷类次生代谢途径中的类黄酮合成途径，类黄酮类化合物是植物花青素的主要成分，是花卉、果实、种皮重要的成色物质。DFR是类黄酮/花青素生物合成途径的一个关键酶，在类黄酮途径中，DFR催化二氢黄酮醇，如二氢堪非醇 （dihydrokaempferol， DHK）、二氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氢杨梅素（dihydromyricetin，DHM）），分别生成无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素（翠雀素），最后在各种修饰酶的作用下形成稳定的花色苷类物质。研究发现，来自不同物种的DFR结合底物的特异性有所不同，对不同底物催化活性也不相同，因而植物中DFR的结构及催化活性对形成不同花色具有决定性的作用。矮牵牛花色丰富，是非常重要的园艺花卉植物，因其植株再生容易，遗传背景清楚，因此也是研究植物花色的模式植物之一。试验利用不同花色（红色及蓝色）矮牵牛品种中克隆获得的PhDFR基因，构建不同筛选标记的植物表达载体，为了进一步研究这2个DFR基因的功能及对植物花色性状的影响提供了良好的前期基础，同时也为植物花色改良相关基因工程提供候选基因及备选植物表达载体。
目前植物基因工程商业化应用最广泛、效果最好的就是除草剂抗性基因和抗虫基因。除草剂抗性基因中研究应用较多的是Bar基因，其表达产物可以提供对草丁膦（PPT）类除草剂的抗性，因此抗除草剂基因既可作为目的基因，又可作为筛选标记基因。试验分别重组构建了PhDFR基因的pCAMBIA2300系列和pCAMBIA 3301系列的2类植物表达载，分别可以用于筛选剂卡那霉素和除草剂Basta（PPT）的植物遗传转化。经过酶切鉴定以及转基因植株GUS染色，基本可以确定植物表达载体构建正确。
在构建载体的过程中，不仅要了解清楚载体上已有的酶切位点，还要注意目的基因片段内部是否有和载体上相同的酶切位点，这对于酶切连接至关重要。在试验中，在PhDFR基因上游起始密码子处设计了带有酶切位点KpnI的引物，在下游终止密码子处设计了带有XbalI的引物，便于将目的基因引入实验室保存的pCAMBIA2300FTGFP载体，形成35S启动子控制的PhDFRGFP的融合基因表达盒。pCAMBIA2300系列载体是含有Km筛选标记的常用植物表达载体，然而考虑到最终抗除草剂转基因农作物的生产应用优势，又将pCAMBIA2300PhDFRGFP中PhDFRGFP所在的表达框用EcoRIPstI双酶切，插入到表达载体pCAMBIA3301OCS中相应的位点，获得了含有目的基因PhDFR融合GFP的pCAMBIA3301系列表达载体。最终构建的pCAMBIA3301PhDFRGFP含有报告基因GUS、GFP以及除草剂抗性基因Bar的植物表达载体。其中GUS筛选基因编码的β葡萄糖苷酸酶，能够将作用底物5溴4氯3吲哚葡萄糖苷酸（XGluc）转化形成不溶解的深色的靛蓝色物质，使得表达GUS基因的部位呈现蓝色。此外，GUS基因可以作物融合蛋白，可以定量分析，有方便快捷的特点。因此，GUS基因成为目前广泛应用于植物转基因实验中的重要报告标记。有人认为田间卡那霉素检测结合室内GUS检测同时进行转基因后代的纯合选育是一个切实可行的方法[11]。由于植物细胞具有细胞壁，为使底物更好进入细胞，可采用抽真空促进渗透的办法，如果不抽真空，在植物叶片上蓝色沉淀就会少一些，有时候甚至检测不出来[12]。融合基因GFP具有优异的报告基因的特点[13]：无需底物或辅助因子，容易检测，反应灵敏；植物本身不含GFP，不受假阳性干扰；荧光性质稳定，便于观察；对转基因生物细胞无毒害，可借助荧光显微镜实现活细胞非损伤性筛选；基因编码序列短，构建载体方便，构建融合蛋白优势明显；广谱性，可用于不同属种的动植物及微生物。因此结合GFP可以对转基因植物进行进一步检测，可以避免GUS染色出现假阴性，同时也进一步提高了试验的准确性，丰富了检测的方法，使实验结果验证更加充分可靠。
试验同时构建了卡那霉素及Bar筛选标记基因的PhDFR植物表达载体，可用于适合不同筛选剂的植物遗传转化，为进一步研究该基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础；同时所构建的pCAMBIA3301系列表达载体为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达载体，其不仅可以通过 GUS 染色对转基因植物进行快速鉴定，而且还融合了GFP报告基因，使目的基因的精确组织表达定位成为可能，载体上丰富的酶切位点也适合于其他基因超表达载体的构建。
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