摘要：以水琼脂表面涂布法对早熟禾（Poa annua L.）和狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]进行筛选敏感度和抗真菌能力的比较。测试了狗芽根种子在温度、培养基量、生长时期3种不同条件下对标准化合物的敏感度。结果表明，狗芽根比早熟禾对除草剂标准化合物更敏感，且有更强的抗真菌污染能力。狗芽根种子在25 ℃的条件下，对除草剂标准化合物的敏感度最高；减少水琼脂用量，即提高样品的终浓度，等同于提高狗芽根筛选的敏感度；狗芽根种子培养48 h后，对标准化合物敏感度最高。对1 880个微生物源提取物进行筛选，表明狗芽根作为单子叶杂草，用于先导化合物筛选具有稳定、高效、敏感度高等突出优点；狗芽根是目前单子叶除草剂先导化合物筛选的首选靶标。
关键词：早熟禾（Poa annua L.）；狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]；先导化合物；除草活性；单子叶植物
中图分类号：S482.4 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2018）20-0089-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： The screening sensitivity and antifungal contamination ability of Poa pratensis and Cynodon dactylon under artificial conditions were compared. C. dactylon had been assayed for their responses to 2 herbicide compounds under different temperature，amount of agar-solution and growth period. The results showed that C. dactylon was more sensitive to herbicide standard compounds and also stronger in antifungal ability than P. pratensis. C. dactylon showed the highest sensitivity at 25 ℃. C. dactylon showed the most sensitive to standard compound after 48 h incubation，reducing the amount of agar-solution could improve the final concentration of the compounds，it was equivalent to increasing the sensitivity of the C. dactylon screening. The screening of 1 880 real extracts showed that C. dactylon was stable，high efficiency，and high sensitivity target of monocotyledon weed for the screening. C. dactylon was one of the top choices of monocotyledon for screening of herbicide lead compounds.
Key words： Poa pratensis L.； Cynodon dactylon （L.） Pers.； lead compound； herbicidal activity； monocotyledon
适用于除草剂先导化合物筛选的单子叶杂草较少，早熟禾通常作为单子叶除草剂活性评价的靶标，但用于先导化合物的筛选却存在春化时间长、发芽时间长及易受真菌污染等不足之处。先导化合物的筛选与除草剂农药活性生物测定在样品性质、靶标设定方面有很大差别。除草剂先导化合物筛选要求筛选通量大，目标化合物通常是低含量、低活性的先导化合物。用于初筛的样品通常为成分复杂的粗提物，是引起真菌污染的良好营养源，所以除草剂先导化合物筛选的关键不仅要提高检测敏感度和增加筛选通量，同时供试靶标的抗污染能力也很重要。狗芽根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]是常用草坪植物，资源充足，品种纯净。使用狗芽根替代早熟禾进行除草剂先导化合物筛选，不仅提高了筛选的敏感度，减少了真菌污染，且突破了使用早熟禾种子在种子资源少、品质差异大以及不能脱壳而易受真菌污染等不利因素的限制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 杂草种子 狗芽根和早熟禾（Poa pratensis L.）种子均为市售，保存在具透气塞的玻璃烧瓶中，温度为8 ℃。狗芽根种子已脱壳，早熟禾种子未脱壳。
1.1.2 主要仪器 蠕动泵、96通道半自动移液机（型号INTEGR，VIAFLO 96）、96孔组织培养板（深孔）、日光灯管组（0.4 m距离光强为7 000～8 000 lx）、人工气候箱（光、温可调）、无菌操作台。
1.1.3 试剂及标准化合物 琼脂粉由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号DH010-4；75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液；乙醇、吐温-80试剂，均为市售分析纯化学试剂；除草剂标准化合物草伏（Norflurazon 95%）、硝磺草酮（Mesotrione 98%）；放线菌和真菌发酵提取物，由湖北省生物农药工程研究中心先导化合物研究室提供。
1.2 方法
1.2.1 早熟禾、狗芽根种子除菌处理及筛选用培养板制备 早熟禾、脱壳狗芽根种子经除菌处理后以无菌水反复振荡、浸洗5次以上，移除积水，种子摊开置于无菌操作台中吹干，备用。把经过高压灭菌后的水琼脂加入96孔组织培养板（深孔）[1，2]，每孔水琼脂加入量根据试验需要进行定量，冷却后备用。把早熟禾、狗芽根种子分别转接到琼脂表面，接入种子量以单层种子全部覆盖水琼脂表面为准。
1.2.2 筛选用样品溶液 以含0.1%吐温-80无菌水作为溶剂进行制备。
1.2.3 早熟禾、狗芽根在水琼脂培养基表面的抗真菌污染能力试验 按“1.2.1”的方法接入早熟禾、狗芽根种子，分别分成4组进行试验：未除菌种子、除菌种子、除菌种子加溶剂对照、除菌种子加培养基对照。把无菌水制备10%的乙醇溶液作为对照溶剂，把空白培养基提取获得的提取物配制成1 mL溶液，作为空白培养基对照。溶剂对照和空白培养基对照表面涂布量为0.02 mL/孔，移液后置于无菌操作台中，静置4 h后移入人工气候箱中培养。第3天开始以目测法确定各培养孔中是否有真菌污染，统计各培养板中被真菌污染的孔数。每个试验组分别使用两块培养板，持续记录到第4天，统计真菌浸染率。重复试验3次。培养条件为：温度25 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度8 000 lx。
1.2.4 早熟禾、狗芽根对除草剂标准化合物的敏感度试验
1）活性评价指标。根据活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记除草活性[3]。
2）早熟禾、狗芽根对除草剂标准化合物的敏感度试验[4]。把标准化合物配制成母液，浓度为1.00 mg/mL，以含0.1%TW-80的无菌水稀释成12个不同的浓度梯度。各组织培养板中琼脂加入量为1 mL/孔，按“1.2.1”方法接入狗芽根和早熟禾种子。每个浓度设2个复孔，重复试验3次。培养条件同“1.2.3”。5 d后检查并记录结果，计算IC50。
1.2.5 进一步提高狗芽根对除草剂标准化合物的敏感度试验
1）不同的培养温度对狗芽根的筛选敏感度比较试验。把硝磺草酮配制成母液，浓度为1.00 mg/mL，以含0.1%TW-80的无菌水稀释成12个不同的浓度梯度（下同）。表面涂布样品溶液量为0.02 mL/孔，按“1.2.1”方法接入狗芽根种子。每个浓度设2个复孔，重复试验3次。培养条件为：温度20、25、28、31 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度8 000 lx。5 d后检查并记录结果，计算IC50，同时统计对照溶剂种子的发芽率。
2）不同的水琼脂加入量对狗芽根的筛选敏感度比较试验。把两个标准化合物分别配制成母液，浓度梯度与上述相同。不同组织培养板中水琼脂加入量不同，分别为1.0、0.5、0.3 mL/孔。表面涂布样品溶液量为0.02 mL/孔，按“1.2.1”的方法接入狗芽根种子。每个浓度设2个复孔，重复试验3次。培养条件同“1.2.3”。5 d后檢查并记录结果，计算IC50。
3）狗芽根种子预先培养不同时间后加入标准化合物，对狗芽根的筛选敏感度比较试验[5]。把硝磺草酮（98%）配制成母液，浓度梯度与上述相同。不同组织培养板中水琼脂加入量为1.2 mL/孔，按“1.2.1”的方法接入狗芽根种子，移入培养室中，分别培养0、1、2、3、4 d后加入标准化合物溶液。表面涂布样品溶液量为0.02 mL/孔。每个浓度设2个复孔，重复试验3次。培养条件同“1.2.3”。各组试验分别在加样5 d后检查并记录结果，计算IC50。
1.2.6 微生物源提取物筛选试验 随机选择1 880个放线菌、真菌发酵提取物样品，首先分4批用狗芽根进行初筛。筛选出来的活性样品再同时用狗芽根和早熟禾进行复筛。比较狗芽根及早熟禾对活性样品的重现性。放线菌、真菌发酵提取样品先用0.1 mL乙醇（在母液中溶剂浓度为10%）溶解，加入0.9 mL含0.1%TW-80的无菌水稀释成母液。初筛剩余样品放入4 ℃冰箱室保存备用。初筛、复筛样品加入量均为0.02 mL/孔。以0.1% TW-80和10%乙醇无菌水作为空白对照。按“1.2.1”方法接入狗芽根或早熟禾种子。每个样品设2个复孔。培养条件同“1.2.3”。5 d后检查并记录结果。
2 结果与分析
2.1 早熟禾、狗芽根在水琼脂培养基表面的抗真菌污染率
未经除菌处理的早熟禾和狗芽根种子在自然条件下都能正常萌发，通常不受真菌污染的影响。但在以水琼脂为培养载体的室内筛选中，真菌污染非常严重，当真菌污染率大于15%时，种子萌发和幼芽的正常生长都会受到抑制，导致试验呈假阳性。结果（表1）显示，常规的除菌处理，对早熟禾种子抗真菌污染的作用有限，培养第5天时真菌已经抑制了正常幼苗的生长，空白培养基的加入加剧了真菌的污染；经过常规的除菌处理后，狗芽根种子在培养第7天，真菌污染率仍小于15%，对幼苗生长无影响，但空白培养基的加入也会加剧培养板内真菌污染。
2.2 早熟禾、狗芽根对除草剂标准化合物的敏感度
由表2可知，狗芽根对两种标准化合物的IC50均小于早熟禾。为了计算方便，本试验中没有采用培养基中的终浓度，而是采用表面涂布的母液浓度，每孔涂布样品溶液量为20 μL。
2.3 进一步提高狗芽根筛选敏感度的方法
2.3.1 不同培养温度对狗芽根筛选敏感度的影响
狗芽根为暖季型杂草，高温有利于种子萌发、植株生长，对除草剂的抗性也增强。结果（表3）显示，随着温度升高，狗芽根对除草剂敏感度降低，同时种子发芽率也升高。综合比较温度对种子的敏感度和发芽率的影响，选择25 ℃作为筛选标准温度。
2.3.2 不同水琼脂加入量对狗芽根筛选敏感度的影响 结果（表4）显示，琼脂加入量由1 mL降低到0.4 mL后，狗芽根对草伏和硝磺草酮的IC50平均值分别下降了43.54%和55.43%。
2.3.3 狗芽根种子预先培养不同时间后加入标准化合物对筛选敏感度的影响 各培养板需要培养5～11 d，为保障水琼脂在长时间培养中持续为狗芽根提供足够水分，各组培养板中加入水琼脂的量均增加到1.2 mL。预先培养0～4 d后加入标准化合物，各组对应IC50依次为（225.00±43.30） μg/mL、（129.00±6.93） μg/mL、（113.33±20.21） μg/mL、（208.33±72.19） μg/mL、500 μg/mL。结果（图1）显示，种子加入培养板，预先培养1～2 d后加入标准化合物溶液的IC50比其他时间加入样品的IC50明显降低。综合培养中真菌污染程度与培养时间的关系，在实际筛选中选择接种后继续培养1 d后加入待测样品。
2.4 微生物源提取物筛选
随机选择了1 880個放线菌、真菌提取物样品，用狗芽根进行初筛。然后用检出的活性样品对狗芽根和早熟禾进行复筛。1 880个样品用狗芽根进行初筛后，检出活性样品31个；对初筛获得的31个活性样品进行复筛，以狗芽根进行的复筛有30个样品能重现活性，以早熟禾进行的复筛中有7个样品能重现活性。这一结果与狗芽根和早熟禾对标准化合物的敏感度差异一致。
3 讨论
微生物源除草剂先导化合物筛选的主要障碍有两个。其一是真菌污染。在无菌的水琼脂培养基上，真菌污染种子的速度极快，被污染的种子发芽及植株生长会受到抑制，引起假阳性结果。早熟禾种子不能脱壳，其颖壳不仅降低除菌效果，而且颖壳还是真菌生长的良好培养基。过度除菌处理会降低种子发芽率，也会引起假阳性结果；二是种子的敏感度直接影响活性样品的检出率。以硝磺草酮为例，当样品中硝磺草酮含量达到50 μg/mL左右时，在以狗芽根为靶标的筛选体系中能被发现。而在早熟禾为靶标的筛选体系中，只有当样品中硝磺草酮含量达到200 μg/mL左右时，才可能被检出。本研究虽然通过几种方法提高了单子叶杂草靶标的筛选敏感度，但与双子叶杂草的筛选靶标拟南芥（硝磺草酮含量0.05 μg/mL左右即可检出）相比，还存在极大的差距[4]。从目前进行的不同杂草种子敏感度筛选试验可以发现，种子越小，其筛选敏感度越高[6]。能够发现一个适用于除草剂先导化合物筛选的敏感单子叶杂草靶标，同时能产出足量的种子供高通量筛选，目前仍然是较大的挑战。
参考文献：
[1] 张志元，罗永兰，官春云.油菜种子内生菌的检测及杀菌消毒处理方法[J].湖北农业科学，2005，45（1）：52-55.
[2] 逄 森，袁会珠，李保同，等.利用96孔板建立除草剂微量活体筛选方法初探[J].农药学学报，2005，7（4）：334-338.
[3] 许勇华，台方俊，陈 杰.新农药创制中除草活性评价程序及方法概述[J].现代农药，2009（5）：17-20.
[4] 张志刚，杨自文，王开梅，等.除草剂组合靶标筛选的研究[J].湖北农业科学，2013，52（23）：5757-5759，5810.
[5] 蓝 添，陈婷婷，邵明伟，等.稻蝗肠道真菌的除草活性筛选及菌株DH03的鉴定[J].植物保护，2014，40（3）：82-86.
[6] 付 颖，叶 非.生物源除草剂研究与使用进展[J].农药，2002， 41（5）：7-10，17.