摘要：用不同浓度天然产物东莨菪内酯处理桑叶饲喂家蚕（Bombyx mori）后，通过测定家蚕头部乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，研究东莨菪内酯对家蚕的影响。结果表明，12 h时家蚕出现摆头、吐液等轻微中毒症状，24 h时中毒症状减轻，48 h时中毒症状消失，家蚕恢复正常；5龄第三天家蚕饲喂浸过不同浓度东莨菪内酯的桑叶后，头部AChE比活力变化趋势与对照变化趋势相反，且除了药后24 h时的比活力高于对照外，其余时间段比活力均显著低于对照，表现为抑制作用；在一定浓度范围内，东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE活性的抑制作用呈剂量效应关系，且抑制率随东莨菪内酯浓度的升高而升高。5.0×10-2、
2.5×10-2 mol/L东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE活性的抑制率分别达到99.4%、90.6%，当东莨菪内酯浓度小于5.0×10-4 mol/L时，其对家蚕头部离体AChE活性的抑制趋势逐渐变缓，抑制中浓度IC50为4.03×10-3 mol/L。
关键词：东莨菪内酯；家蚕（Bombyx mori）；乙酰胆碱酯酶
中图分类号：S881.2； S482.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1106-03
乙酰胆碱酯酶（Acetyleholinesterase，AChE）是昆虫神经系统中最重要的酶系之一，在中枢及外周神经系统中与乙酰胆碱受体一起参与完成神经-神经、神经-肌肉突触之间动作电位的传递，其主要生理功能是催化水解阳离子性神经递质乙酰胆碱，维持神经冲动正常传递[1]。若乙酰胆碱酯酶与杀虫剂接触，其活性部位与杀虫剂不可逆地结合，导致乙酰胆碱不能被水解，酶失活，乙酰胆碱在突触处积累，过量的乙酰胆碱造成去极化阻断，从而抑制正常的神经传导，导致昆虫中毒死亡[2，3]。东莨菪内酯（Scopoletin）又称莨菪亭、莨菪酚、东莨菪甙元、7-羟基-6-甲氧基香豆素等，是广泛存在于植物中的香豆素类化合物，大部分的药用东莨菪素是从伞形科植物防风、白云花和旋花科植物丁公藤和光叶丁公藤中提取而来[4]，是一种天然产物，且在桑树的叶、根、皮中也含有此类物质。
研究表明，有机磷、氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（AChE）有强烈的抑制作用[5-7]。在天然产物活性物质中，AChE的酯动部位抑制剂毒扁豆
碱 [8，9]，以其为模板合成的氨基甲酸酯类农药已经成为一种农药生产上的主要杀虫剂。但东莨菪内酯对昆虫体内乙酰胆碱酯酶的活性影响研究的报道较少，本研究选择鳞翅目模式生物昆虫家蚕（Bombyx mori）作为研究对象，通过研究东莨菪内酯对家蚕活体和离体乙酰胆碱酯酶活性的影响，为进一步探讨东莨菪内酯杀虫机理提供参考，为以后开发既不影响家蚕正常生长发育又能防治桑树害虫的东莨菪素类植物源杀虫剂提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
家蚕品种：菁松×皓月，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所提供。
1.2 主要试剂和仪器
主要试剂：东莨菪内酯（Scopoletin），由西南大学植保学院天然产物农药研究室提供；
1.6 mmol/L 碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATChI），ACROS ORGANICS公司生产；5，5’-二硫代双硝基苯甲酸[5，5’-dithio-bis （2-nitrobenzoic acid）]（DTNB），Damas-beta公司生产；1 mg/mL牛血清白蛋白标准品（Albumin bovine serum），云科生物工程公司生产；考马斯亮蓝G-250，北京索莱宝科技有限公司生产。
主要仪器：高速冷冻离心机、xMark酶标仪、玻璃匀浆器。
1.3 活体抑制施药方法
采用浸叶法，将新鲜桑叶分别浸入不同浓度（0.104、0.078、0.052、0.026 mol/L）的东莨菪内酯药液中，叶片全部浸湿，对照以蒸馏水浸叶，10 s后取出室温条件下自然晾干，按正常的饲喂量饲喂5龄第三天家蚕，每个浓度3次重复，饲喂3 h后，去除未吃尽的桑叶，之后以新鲜无毒桑叶饲喂，观察家蚕中毒症状，且每隔8 h取家蚕于-80 ℃冰箱保存待用，至48 h，共取样6次。
1.4 活体抑制粗酶液制备
将所取样品家蚕头部剪下，0.9% NaCl生理盐水清洗，以1：5（m：V）的比例于0.01 mol/L磷酸缓冲液（1 mmol/L EDTA，l% TritonX-100，1 mol/L NaCl，pH 8.0）冰浴，研磨成匀浆，匀浆液于4 ℃，15 000 r/min离心20 min，取上清液作为待测酶液。
1.5 蛋白质及AChE活性测定
1.5.1 酶源蛋白质含量测定 参照文献[10]中的考马斯亮蓝G-250法测定酶源蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准蛋白。
1.5.2 AChE活性测定 参照张莹等[11]的酶活性测定方法，以0.8 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱（ATChI）为反应底物，0.125 mmol/L 5，5’-二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂。取待测酶液50 ？滋L与100 ？滋L ATChI底物混匀放在40 ℃酶标仪中保温10 min后，加入100 ？滋L DTNB显色剂显色并终止反应，在412 nm下测定光密度（OD），按（1）式计算AChE的比活力[2，12]。
AChE 比活力=■ （1）
式中，V表示反应体系的总体积（mL）；S表示反应体系中所加酶液体积（mL）；M表示反应体系中AChE的实际蛋白质含量（mg）；消光系数 e=13.6；光程L=1 cm。
1.5.3 AChE离体活性测定 提取正常条件下饲养至5龄第三天家蚕头部粗酶液待用，配制5.0×10-2、2.5×10-2、5.0×10-3、2.5×10-3、5.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-5、2.5×10-5 mol/L系列浓度东莨菪内酯抑制剂（0.05 mol/L磷酸缓冲液稀释），参照文献[13]的方法测定AChE残余活力，根据公式（2）计算抑制率[2，14]，每个处理设1个空白和3次重复。
抑制率 =[OD对照-（OD处理-OD空白）]/ OD对照×100% （2）
式中，OD处理指待测液中添加酶液和抑制剂；OD空白指待测液中不添加酶液，添加与处理相同浓度的东莨菪内酯抑制剂；OD对照指待测液中添加酶液，未添加抑制剂。
1.6 数据分析
运用SPSS 13.0软件的Probit模块对试验结果进行分析，求出乙酰胆碱酯酶（AChE）比活力、抑制率、得出回归方程及IC50值。
2 结果与分析
2.1 家蚕中毒症状
用东莨菪内酯处理过的桑叶饲喂家蚕，3 h后观察到大部分药剂处理过的桑叶被家蚕取食，但家蚕未表现出中毒症状；移除未吃尽桑叶，之后以新鲜无毒桑叶饲喂，12 h时观察到食下高浓度（0.104、0.078 mol/L）东莨菪内酯处理叶片的部分家蚕出现摆头现象，与对照相比行动迟缓，少数静卧在桑叶上，有轻微吐液，且取食量少于对照，食下低浓度（0.052、0.026 mol/L）处理叶片的家蚕中毒症状较轻；24 h时观察到大多数家蚕中毒症状减轻，且取食量较12 h时增加；48 h时观察到摆头、吐液等中毒症状消失，家蚕基本恢复正常状态，与对照相比差异不大。在整个中毒过程中没有出现家蚕死亡的现象。
2.2 东莨菪内酯对家蚕头部AChE活性的影响
东莨菪内酯对家蚕头部AChE活性的影响如图1所示。家蚕食下毒叶后，8 h时测得各浓度处理后的家蚕头部AChE比活力与对照差异不大，16 h与对照相比显著降低，且东莨菪内酯浓度越高AChE比活力越低；24 h时各浓度处理后的AChE比活力均比16 h时升高且都高于对照；32 h时对照AChE比活力比24 h时显著升高，但各浓度处理后的AChE比活力比24 h时降低，与对照差异较大，之后各浓度处理后的AChE比活力逐渐降低，且差异不大，但都显著低于对照。总体来看，添食东莨菪内酯处理的毒叶后，家蚕头部AChE比活力变化趋势与对照变化趋势相反，说明东莨菪内酯对家蚕头部AChE活性有一定影响，且表现为抑制AChE活性，并随东莨菪内酯浓度的升高，AChE受抑制作用增强。
2.3 东莨菪内酯对家蚕离体AChE活性的影响
测定不同浓度东莨菪内酯作用下家蚕头部离体AChE的抑制活性，按公式（2）计算出抑制率，以抑制率对抑制剂浓度的负对数作图，如图2所示。东莨菪内酯在一定浓度范围内对家蚕头部离体AChE活性的抑制作用呈明显的剂量-效应关系，且对AChE活性的抑制率随东莨菪内酯浓度的升高而升高。5.0×10-2 、2.5×10-2 mol/L东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE活性的抑制率分别达到99.4%和90.6%，当东莨菪内酯浓度小于5.0×10-4 mol/L后，其对家蚕头部离体AChE活性的抑制趋势逐渐变缓。根据药剂对AChE活性抑制的剂量-效应关系，求出东莨菪内酯对家蚕头部离体AChE的回归方程为y=1.689x+4.045，抑制中浓度IC50值为4.03×10-3 mol/L。
3 讨论
东莨菪内酯属香豆素类化合物，广泛存在于丁公藤、地骨皮、白芷、胡卢巴、黄花败酱、桑树等多种常见植物中，是从植物中提取的天然产物。在医药领域，根据公认的病理-胆碱能缺失学说，已有大量研究表明，通过东莨菪内酯抑制乙酰胆碱酯酶活性，降低乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱的能力，增加脑内乙酰胆碱含量，可有效治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），即老年痴呆症[15-17]。Furey等[18]研究发现静脉注射东莨菪碱（4 μg/kg）可以迅速减轻抑郁症患者的抑郁程度，刘悦等[19]也研究发现东莨菪碱能够有效改善网瘾患者伴发的抑郁症状。通过此类相关研究可明确，乙酰胆碱酯酶不仅是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，也是东莨菪内酯的作用靶标。也有研究表明，东莨菪内酯对桑园害螨——朱砂叶螨有触杀作用，且能显著抑制朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，其LC30、LC50、LC90值分别为0.872、1.243、2.956 mg/mL[20]，可作为植物源杀螨剂进一步开发利用。
4 结论
本研究结果表明，东莨菪内酯在较高浓度（0.104、0.078 mog/L）时可引起家蚕轻微中毒症状，低浓度（0.052、0.026 mog/L）时观察到的中毒症状不明显，且中毒症状均在48 h后消失，家蚕恢复正常；东莨菪内酯对家蚕头部AChE活性表现出抑制作用，且抑制作用随东莨菪内酯浓度升高而增强。综合观察结果和试验结果，虽然高浓度东莨菪内酯在一定程度上会引起家蚕轻微中毒，但是低浓度没有观察到明显的中毒症状，在桑园中如果选用适当浓度东莨菪内酯作为植物源杀虫剂，既能保证桑叶对家蚕的安全性，又能防治桑园害螨，为进一步研究东莨菪内酯在桑园害虫防控方面奠定基础。
参考文献：
[1] LI F，HAN Z J. Purification and characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid Aphis gossypii Glover）[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2002，51（1）：37-45.
[2] 彭 霞.农药靶标乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究[D].成都：四川大学， 2007.
[3] SHANG J Y， SHAO Y M，LANG G J，et al.Expression of two types of acetylcholinesterase gene from the silkworm， Bombyx mori， in insect cells[J].Insect Science， 2007，14（6）：443-449.
[4] 方 专，何光力，何 菱.微波辅助合成东茛菪素[J].华西药学杂志，2007，22（3）：302-303.
[5] 马 惠.农药对家蚕的毒性评价研究[D].济南：山东农业大学， 2006.
[6] 陈小平，青学刚，严欲民，等.常用新农药对家蚕的毒力及残效期研究[J].四川蚕业，2005（2）：12-24.
[7] 顾 颖，王雨轩，王 斌，等.六种农药对乙酰胆碱酯酶活性的体外毒性效应[J].农村生态环境，2004，219（2）：70-73.
[8] 张赟彬，宋 庆，胡刘岩.天然产物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展[J].上海应用技术学院学报（自然科学版），2011，11（1）：1-6.
[9] 边红玲.毒扁豆碱的结构修饰及抗胆碱酶构效关系的研究[D].杭州：浙江工业大学，2009.
[10] BRADEFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72： 248-254.
[11] 张 莹，黄 建，高希武，等.两种蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶对杀虫药剂敏感度比较[J].农药学学报，2005，7（3）：221-226.
[12] 黄 晓，滕 云，陶 科，等.天然产物对家蚕乙酰胆碱酯酶抑制作用研究[J].四川动物，2008，27（3）：327-330.
[13] BYRNE F J，DEVONSHIRE A L. Insensitive acetylcholinesterase and esterase polymorphism in susceptible and resistant population of the tobacco whitefly Bemisia tabaci（Genn.）[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，1993，45（1）：34-42.
[14] 殷帅文，刘丽萍，王安萍，等.15种植物不同溶剂萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究[J].井冈山大学学报（自然科学版），2012，33（4）：52-56.
[15] 邹 垒，全明海，程永强，等.乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展[J].食品科学，2005，26（增刊）：105.
[16] 王 铮，祝 勇.阿尔茨海默病的发病机制与药物治疗[J].亚太传统医药，2007，3（11）：83-86
[17] 杨中铎，任 晋，薛鹏辉，等.藏药中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选[J].中国实验方剂学杂志，2011，7（2）：194-196.
[18] FUREY M L， DREVETS W C. Antidepressant efficacy of the antimuscarinic drug scopolamine： A randomized， placebo-controlled clinical trial[J]. Arch Gen Psychiatry，2006，63： 1121-1129.
[19] 刘 悦，杨国栋，姚新民.药物干预和心理疏导治疗网络成瘾综合征40例临床疗效观察[J].中国药物滥用防治杂志，2007（2）：88-91.
[20] 梁 为，白雪娜，马兰青，等.东莨菪素对朱砂叶螨的毒力及杀螨机理初探[J].广东农业科学，2011（8）：68-71.