[摘要] 目的 研究游离空肠修复气管部分缺损后的组织学变化，为其应用于临床提供实验依据。 方法 通过建立游离空肠重建气管部分缺损动物实验模型，包括A组Beagle犬6条（不去除肠黏膜组），B 组Beagle犬6条（部分去除肠黏膜组）及C组Beagle犬6条（全部去除肠黏膜组），观察术后犬的存活及肠腺分泌对呼吸道的影响，动态观察各实验组的空肠腺上皮在光镜和电镜下的变化及上皮化生情况。 结果 所有实验犬术中无死亡，创口Ⅰ期愈合，移植游离空肠全部成活。A组有2条Beagle犬在术后第2周因肺部感染死亡，C组有1条Beagle犬在术后第50天因移植空肠感染而死亡，其余Beagle犬均存活6个月以上。A组术后3个月，移植空肠肠腔表面出现少量非角化鳞状上皮；术后6个月时，移植空肠表面见假复层纤毛柱状皮覆盖。B、C组术后2个月，移植空肠表面见鳞状上皮化生；术后3个月，移植空肠肠腔表面见少量假复层纤毛柱状上皮；术后 6 个月，移植空肠表面全部见假复层纤毛柱状上皮覆盖，C组黏膜下层有明显胶原纤维增厚。 结论 去部分黏膜游离空肠重建气管，能有效减少术后肠液分泌，减少对呼吸道的影响，能加速肠黏膜腺上皮萎缩，促进假复层纤毛柱状上皮覆盖，为其应用于临床提供了实验依据。
[关键词] 气管重建；空肠；自体移植；微血管吻合
[中图分类号] R653 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0012-04
因肿瘤、创伤、先天性疾病等需要切除部分气管，但当切除超过6 cm时难以端端吻合，临床工常作中这种情况常可以遇到。由于长段气管缺损重建存在着再血管化、管腔支撑、上皮覆盖、排斥反应等难题，因此，这类患者常被视为手术禁忌。6 cm以上气管缺损修复、重建的研究多年来一直是国内外学者十分关注的难题。随着游离空肠移植重建气管方法的日益广泛研究，先进的显微技术及合适的支架运用，使移植的游离空肠再血管化、管腔支撑及排斥反应这些难题都已一一迎刃而解，但仍存在空肠移植术后腺体分泌及上皮覆盖这两大难题。本研究拟在建立游离空肠重建气管部分损模型的基础上，观察术后犬的存活及肠腺分泌对呼吸道的影响，动态观察各实验组的空肠腺上皮在光镜和电镜下的变化及上皮化生情况，从而了解游离空肠重建气管后的上皮转化规律，为游离空肠重建气管应用临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选国际通用标准实验动物Beagle犬18条，体重10～16 kg，雌雄各半，随机分成A 组，不去除游离空肠肠黏膜；B 组，部分去除游离空肠黏膜；C组，全部去除游离空肠黏膜；每组各6只。
1.2 实验方法
实验动物用氯胺酮4～10 mg/kg静脉麻醉，不行气管插管。手术分颈、腹部两组同时进行。颈部手术：解剖颈部气管及血管，先行颈部正中纵行切口，上起环状软骨下至胸骨上切迹，分离带状肌，逐层切开，完全暴露颈部气管；剪开一侧颈动脉鞘，解剖出颈总动脉和颈内静脉，用橡皮筋做好标记，备血管吻合时用。腹部手术：采用脐上正中切口，进入腹腔，寻找空肠，选取长约5 cm空肠段，分离肠系膜动静脉，使二者游离约2 cm，用肠钳夹住截取肠段，暂不断蒂，先行空肠两断端吻合。断血管蒂后，即用0.1%肝素生理盐水灌洗动脉，至静脉端流出澄清液体、肠管变白为止，用络合碘灌洗肠腔后，再用生理盐水冲净。生理盐水、甲硝唑冲洗腹腔，检查无活动性出血后关闭腹腔。将肠系膜动脉与颈总动脉行端侧吻合，再将肠系膜静脉与颈内静脉行端端吻合。吻合成功后，可见肠管由白色变红润。将空肠从对系膜侧剖开。A组Beagle犬（不去除空肠黏膜）直接将肠壁与气管壁缝合；B组 Beagle犬（部分去除空肠黏膜）用小圆刀和黏膜擦除棒10支，深入肠腔擦除空肠黏膜，保留约1/5空肠黏膜，再将肠壁与气管壁缝合；C组Beagle犬（全部去除黏膜层），将肠壁沿系膜侧剖开，全部去除肠黏膜后将肠壁反转，将浆膜层至于管壁内侧，将移植空肠与气管壁缝合起来，建立游离空肠重建气管部分缺损的模型。依次缝合颈前各层组织，并放置引流管，皮肤缝合处涂抹红霉素软膏。术后禁食，把动物放入笼内单笼饲养。术后静脉滴注低分子右旋糖苷，肌内注射罂粟碱，口服阿司匹林，静脉予抗炎治疗。术后注意Beagle犬的一般情况。术后1、2、3、6个月时，各组在氯胺酮静脉全麻下行纤维支气管镜检查，观察移植空肠肠黏膜的颜色、血运，吻合口有无肉芽及瘘道形成，新气道有无狭窄，每次分别在吻合口及移植空肠肠腔中部取活检，共取两份，一份送透射电镜观测，另一份常规石蜡包埋、切片。
1.3 主要观察指标
①观察动物一般情况，包括活动情况、体温、咳嗽、呼吸、造瘘口流出分泌物量等情况；②移植空肠颜色；③新气管通畅度，吻合口处有无肉芽生长；④移植空肠黏膜组织学变化。
2 结果
2.1 动物一般情况
术后18只Beagle犬均无发热，术后均无肠梗阻表现。18只Beagle犬颈、腹部切口均Ⅰ期愈合。A组术后1～2周内均有不同程度的咳嗽，2周后咳嗽明显减轻，3周后基本消失；气管造瘘口术后1周有大量黏液分泌，3周后黏液分泌逐渐减少，有2条Beagle犬在术后第2周因肺部感染死亡。B、C组术后1周气管造瘘口只有少量黏液分泌，咳嗽较轻。C组有1条 Beagle犬在术后第50天因移植空肠感染而死亡
2.2 术后纤维喉镜观察
2.2.1 A组 术后1个月，移植空肠稍水肿，表面光滑，吻合口见肉芽组织，未见瘘道形成；术后2个月时，见移植空肠表面光滑，无水肿，色淡红，与正常气管粘膜色泽相近；术后3个月时，气管管腔通畅，无狭窄及塌陷，与正常气管黏膜颜色一样；术后6个月时，气管管腔通畅，无瘘道，无狭窄及塌陷。
2.2.2 B组 术后1个月，移植空肠黏膜稍充血、水肿，吻合口有少量肉芽组织增生，见连续的上皮层，无瘘道形成；术后2个月时，移植空肠无水肿，表面光滑，色淡红，无狭窄及塌陷；术后3个月时，气管管腔通畅，无狭窄及塌陷，黏膜色泽与正常气管黏膜一样；术后6个月，气管管腔通畅，移植空肠略突向肠腔，无瘘道形成，无狭窄及塌陷（图 1）。
A B
A：术后1个月，纤维喉镜下见空肠黏膜充血、肿胀，吻合口有肉芽增生；B：术后6个月，纤维喉镜下见移植空肠略突向肠腔，气管管腔通畅，吻合口处光滑，无肉芽
图1 B组术后纤维喉镜图
2.2.3 C组 术后1个月，移植空肠黏膜略充血，水肿，吻合口见肉芽组织，未见分泌物及瘘道形成；术后2个月时，移植空肠表面光滑，呈红色，肠黏膜水肿消失，管腔通畅，无狭窄及塌陷，有连续的上皮层覆盖；术后3个月时，气管管腔通畅，无狭窄及塌陷，移植空肠黏膜色泽与正常气管黏膜一样；术后6个月，移植空肠肠壁稍增厚，气管管腔通畅，无明显狭窄及塌陷。
2.3 光学显微镜检查
2.3.1 A组 术后1个月，肠腺萎缩，黏膜层薄，绒毛缩短，绒毛间见大量炎症细胞浸润；术后2个月，移植空肠肠腺进一步萎缩，黏膜层明显变薄，绒毛及腺体萎缩，绒毛间炎症细胞浸润减少；术后3个月，移植空肠肠腔表面见少量非角化鳞状上皮；术后6个月，移植空肠表面见假复层纤毛柱状皮覆盖。
2.3.2 B组 术后1个月，吻合口处有肉芽组织增生，空肠黏膜层变薄，小肠绒毛变短，绒毛间有纤维素渗出和炎细胞浸润；术后2个月时，移植空肠表面见鳞状上皮化生，未见空肠腺体样结构；术后3个月时，移植空肠肠腔表面有假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏膜层有淋巴细胞浸润，固有层见纤维组织；术后6个月，移植空肠见假复层纤毛柱状上皮覆盖（图 2）。
A B
C
A：术后2个月，空肠表面有鳞状上皮化生，未发现肠腺结构；B：术后3个月，空肠肠腔表面有假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏膜层见淋巴细胞浸润；C：术后6个月，肠腔见假复层纤毛上皮
图2 B组术后光学显微镜检查情况（HE，100×）
2.3.3 C组 术后1个月，以浆细胞为主的炎症细胞较多，新生毛细血管较多，肉芽组织增生活跃；术后2个月时，移植空肠表面有鳞状上皮化生，黏膜下层有少量纤维细胞增生；术后3个月时，移植空肠肠腔表面有假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏膜层有淋巴细胞浸润，固有层见纤维组织；术后 6 个月，移植空肠肠腔表面均被假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏膜下层有明显胶原纤维增厚。
2.4 透射电镜检查
2.4.1 A组 术后1个月，肠腺萎缩，吸收细胞绒毛变短，微绒毛开始脱落；术后2个月，仅见少量绒毛，杯状细胞减少，细胞内颗粒减少，分泌细胞的颗粒减少；术后6个月，移植空肠表面见较多纤毛细胞，并有正常纤毛结构，并见浆细胞浸润。
2.4.2 B组 术后1个月，纤维细胞增多，发现有排列整齐的胶原纤维，黏膜层见淋巴细胞浸润；术后2个月，分泌细胞的颗粒减少，见鳞状上皮化生；术后6个月，移植空肠肠腔表面出现具有正常纤毛结构的纤毛细胞，固有层见成纤维细胞，并见淋巴细胞浸润（图3）。
2.4.3 C组 术后1个月，淋巴细胞和浆细胞浸润；术后2个月出现鳞状上皮化生，黏膜下层有少量纤维细胞增生；术后6个月，移植空肠表面出现较多具有正常纤毛结构的纤毛细胞，未见杯状细胞，黏膜下层有较多纤维细胞增生。
3 讨论
临床工作中常遇到因肿瘤、创伤、先天性疾病等需要切除部分气管，但当切除超过6 cm时会有难以端端吻合的情况。由于长段气管缺损重建存在着再血管化、管腔支撑、上皮覆盖、排斥反应等难题，因此，这类患者常被视为手术禁忌者，许多患者因得不到及时、有效的治疗，最终死于呼吸道梗阻。因此，6 cm以上气管缺损修复、重建的研究多年来一直是国内外学者十分关注的难题，也是医学领域中亟待研究解决的课题。随着生物组织工程学的兴起及其技术在临床领域的成功应用，利用生物组织工程学技术构建一个气管替代物，并用其去修复气管缺损开始受到人们的关注，而怎样的气管替代物才更适合临床呢，Belsey[1]和 Costantino等[2]认为，理想的气管替代应具有以下特点：一定的硬度、柔韧性；管腔的气密性；管腔内有连续的呼吸道纤毛上皮覆盖，能发挥纤毛上皮的黏液清除功能；具有良好的血运，抗感染力强，易于愈合；能适用于长段气管缺损；组织相容性好。自身组织修复中常采用皮肤、心包、肌肉、食管、小肠、肋软骨、主动脉等组织，其中，空肠长达2.5 m，具有取材方便、血管比较丰富、血管弓少而且直、可采用带蒂或游离移植、空肠系膜血管与颈部口径相近便于吻合的特点。Costantino等[2]认为，除了缺乏支撑新气道持续开放的硬度外，空肠替代气管较符合以上条件，空肠可作为较接近理想的气管替代物。1986年Jones等[3]首次报道用空肠移植重建气管，获得了成功，为空肠移植重建气管技术开创了新篇章。随着游离空肠移植重建气管方法的日益广泛研究，先进的显微技术及合适的支架运用，使移植的游离空肠再血管化、管腔支撑及排斥反应这些难题都已一一迎刃而解。但是，空肠重建气管要达到较理想的状态，还存在两大难题：一是重建术后移植肠管继续分泌对呼吸系统的影响，二是重建气管段的腔面能否化生为呼吸道上皮。
空肠作为有腺体分泌功能的组织，其分泌物对呼吸系统的影响还存在争议。人小肠每天分泌李氏腺液1～3 L[4]。移植到气管的空肠因大量的分泌物，可引起气管的阻塞；另大量的分泌物可造成另一个菌谱的细菌大量繁殖而致肺炎甚至菌血症，导致重建失败甚至死亡。在小肠替代气管实验研究中，曾有学者设法去除小肠的黏膜层，以减少肠黏液分泌物对呼吸系统造成的影响[5]。Nakayama[6]研究发现，移植空肠未经处理组的12只实验犬中，6只肠液分泌过量，导致新气管阻塞并发肺炎，最终术后20 d内死亡；而移植空肠经过搔刮及烧灼去除黏膜的11只实验犬中仅有1只于术后第9天死于肺炎。Fandrich等[7]也发现，有2只实验动物因分泌的黏液积聚在移植物的远端而致肺水肿和肺不张。而Letang等[5]应用纱布擦去小肠的黏膜层后未发现大量黏液分泌的现象。本实验结果也支持该结果。A组（不去空肠黏膜组）发现气管造瘘口术后 1 周内有较多肠液流出，有2只Beagle犬在术后第2周因肺部感染死亡，而B、C组（部分及全部去空肠黏膜组）术后1周内则有较少肠液流出，咳嗽较轻。然而，过度搔刮全部去除黏膜层，亦会造成术后肉芽生长，上皮生长延迟，因缺乏上皮的覆盖，会减弱动物抵抗病原体感染的能力。本实验中全部去除黏膜层组有1只Beagle犬在术后第50天因移植空肠感染而死亡，估计与上述因素有关。
化生是机体的一种组织因细胞生活环境改变或理化因素刺激，在形态和机能上变为另一种组织的过程，是机体的一种适应现象。正常气管的内壁为假复层纤毛柱状上皮覆盖，黏液-纤毛转用系统在气道防御机制中占有重要地位，是气道的第一道防线。而空肠内腔为单层柱状上皮，有大量小肠腺和绒毛结构，不存在黏液-纤毛转用系统。因此，移植空肠的黏膜上皮完全化生为假复层纤毛柱状上皮，并具有正常的纤毛功能，这是最为理想的气管重建。Letang等[5]擦除了空肠黏膜行肠代气管重建的实验中发现，术后在吻合口附近的空肠腔内有少量的鳞状上皮出现，术后3周有近20%的空肠表面被鳞状上皮覆盖，认为这些鳞状上皮可能起源于附近的正常气管的上皮。Nakayama[6]的研究也观察到类似的现象。本研究在空肠重建气管缺损动物模型的肠膜黏组织变化的研究过程中，也观察到了这一现象：A、B、C三组均在术后6个月，在移植空肠表面见假复层纤毛柱状上皮覆盖，B、C组较A组 早1个月出现假复层纤毛柱状上皮。以上实验结果表明，去部分空肠黏膜能加速移植空肠的上皮化，加速纤毛柱状上皮的化生，但对空肠黏膜的最终化生结果没有影响。
本组实验结果显示，去除部分肠黏膜能有效减少分泌细胞的数量，从而减少移植空肠的肠液分泌，减少分泌物对呼吸系统的影响；去部分肠黏膜能加速空肠黏膜萎缩变薄、绒毛变短脱落[8-9]，促进鳞状上皮化生，减少因缺乏上皮的覆盖，导致病原体的感染，从而促进气管愈合。据此，去部分肠黏膜游离空肠重建气管动物模型是一较为理想的游离空肠重建气管动物模型，其将有望解决空肠移植术后腺体分泌及上皮覆盖这两大难题，使游离空肠重建气管技术更接近理想，为游离空肠重建气管应用于临床提供良好的实验依据。
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（收稿日期：2013-01-29 本文编辑：程 铭）