材料与方法
1.1 实验动物
8周龄SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重130～170 g，由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供。许可证号SCXK新2005-006。
1.2 实验药物
复方芪鹰颗粒，由我院研制，批号ZJ2012006。
1.3 主要试剂与仪器
链脲佐菌素（STZ）购于Sigma公司、Hsp70抗体（Sigma公司），SP-9000免疫組化试剂及DAB显色剂（中杉金桥）、PBS、TBS缓冲液（Boster公司）。石蜡切片机（Rm-2135型，德国Leica公司）；光学显微镜，CX21型，日本奥林巴斯公司。显微成像系统，DM-500，德国莱卡公司。血糖仪，4297A型，台湾博士医生。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型
1.4.1.1 2型糖尿病模型 造模过程参考本课题组前期工作[11]。造模大鼠持续喂以高脂饲料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%猪油）8周。8周后，大鼠禁食14 h后腹腔注射小剂量STZ 35 mg/kg（STZ溶于0.1 mol/L，pH=4.5的枸橼酸缓冲液，配制为1%的溶液）进行造模。之后监测大鼠空腹血糖，选取空腹血糖高于11.1 mol/L的大鼠作为糖尿病模型大鼠。
为防止糖尿病大鼠因血糖过高而无法存活至实验终点，根据所测得的血糖水平予以精蛋白锌胰岛素注射液1～4 U，1 次/d，皮下注射，维持血糖在20.0～25.0 mmol/L（糖尿病组及各治疗组均有此情况）。
1.4.1.2 DPN大鼠模型 在2型糖尿病大鼠的基础上继续高脂饮食4周，之后应用Meditronic keypoint-4 workstation肌电图仪测定糖尿病大鼠下肢坐骨神经的感觉和运动传导速度，糖尿病大鼠造模成功后测定感觉或运动传导速度减慢超过11%，即可判定为成功的DPN大鼠模型[12-13]。
1.4.2 分组与给药
从60只8周龄大鼠中随机取10只为正常组；50只造模，造模成功43只，随机分为4组：模型组（11只）、复方芪鹰颗粒低剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒中剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒高剂量组（10只）。
复方芪鹰颗粒治疗组（1.17、2.34、4.68 g/kg，用纯水分别配为8.45%、16.9%、33.8%的溶液），模型组、正常组均灌以相应容积的蒸馏水，1次/d，每次2 mL灌胃。连续用药4周，实验期间全部大鼠予普通饲料喂养，自由进食和水。
1.4.3 留取标本
所有实验大鼠均在用药4周后处死。将大鼠予10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯卧位固定于手术台上。开腹、开胸暴露心脏，将针头经心尖处插进左心室，剪开右心耳，给予37℃生理盐水灌流，直至流出液无色为止。继续给予4℃、4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液40 mL左右灌流固定，直至大鼠身体变硬为止。固定脊椎，于股骨干后外侧剪开股二头肌与半膜肌之间的皮肤，于大鼠股外侧肌间隙进入，并沿两股间钝性分离，暴露坐骨神经，沿坐骨神经向腰椎内将神经用力拉出，找到膨大的背根神经节，用锐利刀片切取神经节组织，留取坐骨结节至远端胫腓神经分叉处的坐骨神经。将组织置于冻存管内，-80°冻存，备用。
1.4.4 检测指标
1.4.4.1 Hsp70表达测定 Hsp70的免疫组化及平均光密度测定参考文献[14-15]。
1.4.4.2 大鼠坐骨神经损伤纤维 取大鼠左侧从坐骨结节至远端胫腓神经分叉处的坐骨神经，4%甲醛固定，并逐级酒精脱水，12 h后取出，蜡块包埋，切片，Kullshitzky髓鞘染色法染色，用光镜观察坐骨神经髓鞘的病理变化及药物的影响。在每一神经标本纵切片上观察25根有髓神经纤维，计数发生神经病变（结周脱髓鞘、磷脂过度皱褶、结间隙增多、节段性脱髓鞘、髓鞘发生溃变/Wallerian变性）的纤维，计算其占总纤维数的百分率。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，各组实验数据用均数±标准差表示，方差齐时采用t检验；方差不齐时用秩和检验。检验水准α=0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状况
正常组大鼠的一般状况良好，模型组大鼠出现消瘦、多食、多尿症状，各治疗组大鼠在实验过程中，症状均较模型组大鼠轻。在实验期间，模型组死亡3只，复方芪鹰颗粒小剂量组死亡1只。
2.2 各组坐骨神经Hsp70表达水平的比较
复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组大鼠坐骨神经Hsp70表达与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒中、高剂量组大鼠坐骨神经Hsp70表达与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而复方芪鹰颗粒中剂量及复方芪鹰颗粒高剂量组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.3复方芪鹰颗粒对大鼠坐骨神经损伤神经纤维的影响
复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组坐骨神经损伤纤维百分比与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组坐骨神经损伤纤维百分比与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。
3 讨论
Hsp70是一个重要的神经保护分子伴侣，其蛋白结构主要包括一个N端约450个氨基酸残基的高度保守的ATPase功能域和一个C端约200个氨基酸残基的相对保守的区域（肽链结合区），主要是通过帮助蛋白质复性的作用机制，减少神经退行性疾病[16]。在应激条件下，Hsp70可快速转移至细胞核、核仁等附近区域，并可经细胞质进入细胞核，与变性蛋白疏水区结合，限制其相互聚合并解聚已聚合蛋白，恢复正常三级结构。研究表明，Hsp70主要通过抑制炎症信号通路（核因子-κB）而抑制脑内炎症反应，从而发挥保护神经元的作用[17]。尽管DPN的病因没有与某一个特定的错误折叠或聚集蛋白聚合相关，高血糖会增加氧化应激，氨基酸的氧化修饰，可妨碍蛋白质折叠，降低线粒体功能和蛋白导入，增强与分子伴侣的相互作用[18-19]。分子伴侣的调节可以改善DPN中因营养受损的周围神经的胰岛素信号[20]。因此，调节分子伴侣Hsp70对于治疗DPN有重要作用。
复方芪鹰颗粒是胡晓灵主任医师根據中医理论，结合DPN的特点，长期应用于临床，疗效显著[6-10]。它是以消渴为本，痿痹为标，以气阴两虚、痰瘀阻滞、风伏络瘀为根本病机，以益气养阴、祛瘀化痰、疏风通络为法组方，精选黄芪、黄精、鹰嘴豆、丹参、蝉蜕五味中药。君药黄芪甘而微温，归脾肺经，功擅补中益气健脾，向为补气之主将。《别录》谓其“补丈夫虚损，五劳赢瘦，止渴”；《日华子本草》称其可“助气，壮筋骨，长肉，补血”。由是观之，黄芪之补气，本可生津以疗消渴，亦可养血生肌壮筋以起痿症，又能祛风调营达卫而治痹症。臣药黄精甘平，归脾肺肾经，功可补气养阴，健脾润肺益肾。《日华子本草》称之可“补五劳七伤，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，润心肺”；《本草纲目》谓其“补诸虚……填精髓”。本品不仅能补益肺肾之阴，而且能补益脾气脾阴，常与黄芪合用，治疗气虚津亏之消渴。臣药鹰嘴豆性味甘平，无毒，具有补中益气、温肾壮阳、活血解毒、润肺止咳等作用。维吾尔语称之为“诺胡提”，在阿维森纳《医典》及《膳食正要》《本草拾遗》等典籍中均有记述，是药食兼用珍品。本方选用鹰嘴豆，一者与黄精相伍，协助君药，共奏补中益气之功，用作臣药；两者与丹参相合，助其通行血脉之力，兼充佐药之职。佐药丹参苦微寒，归心肝心包经，功可活血祛瘀止痛，凉血消痈，除烦安神。本品善能通行血脉，祛瘀止痛，广泛应用于各种瘀血病证。因其性偏寒凉，对血热瘀滞之证尤为相宜。佐药蝉蜕甘寒，归肺肝经，功可疏散风热，息风止痉。《本草纲目》谓其“治头风眩运，皮肤风热，痘疹作痒，破伤风及疔肿毒疮，大人失音，小儿噤风天吊，惊哭夜啼，阴肿”。本品甘寒入肺经，可祛肺经风热，入肝经，可通络止痉。《外科正宗》消风散治风湿浸淫肌肤血脉，皮肤瘙痒，即用本品疏散肌肤风邪。复方芪鹰颗粒取蝉蜕为佐药，盖以消渴痿痹风邪伏于四肢肌肤络脉之内，非轻清疏达之品不办，蝉蜕性能功治，正可当之。现代药理研究发现，黄精、黄芪、丹参、蝉衣、鹰嘴豆对本病均有一定的治疗作用。
本实验研究发现，复方芪鹰颗粒中、高剂量组与模型组在大鼠坐骨神经的Hsp70表达方面比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而中剂量及高剂量间比较差异无统计学意义（P > 0.05），提示复方芪鹰颗粒能够提高Hsp70的水平。而对于坐骨神经损伤纤维的影响，复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示复方芪鹰颗粒具有减少坐骨神经损伤纤维作用，其原因可能与该药能够提高Hsp70的表达有关。Hsp70的表达上调能够防止神经细胞凋亡[21]，减少神经退行性疾病的氧化应激反应[22]。最近研究支持Hsp70的表达可以通过加速c-Jun的蛋白酶体降解，防止神经调节蛋白1（NRG1）诱导周围神经的脱髓鞘[23]。而Kirkegaard等[24]报道，Hsp70可通过稳定溶酶体膜，阻止溶酶体蛋白酶释放入胞浆，从而抑制经溶酶体通路诱导的细胞凋亡。因此，Hsp70对于神经的保护不仅因为分子伴侣的作用，还有其抑制凋亡的作用。该药物具体机制可能是高表达的Hsp70帮助受损周围神经细胞中错误蛋白质的折叠发挥了分子伴侣的作用，改善了线粒体功能，阻止了细胞凋亡，修复了受损的周围神经的胰岛素信号传导[18-19]，防止了周围神经轴突萎缩、脱髓鞘、再生障碍，从而达到治疗DPN的目的。
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（收稿日期：2016-09-16 本文編辑：王红双）