摘要:采用菌丝生长速率法测定了苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性,建立了以敏感性菌株ECso平均值0.1115±0.0485mg·L-1为标准的敏感性基线。在所测定的菌株当中,84.51%的轮纹病菌菌株对戊唑醇表现敏感。15.49%的菌株对戊唑醇已产生2～5倍的低水平抗药性,抗药性菌株主要分布于山东东部区域。
关键词:苹果轮纹病菌;戊唑醇;抗药性;监测
中图分类号:S661.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2010)06-961-04
苹果轮纹病主要分布于中国、韩国、日本等国家。中国山东省苹果产区发生普遍,近年具有逐年加重的趋势,严重果园发病率超过40%。该病主要危害果实和枝干,且在果实储藏期仍可发病,危害严重。当前化学杀菌剂仍是防治苹果轮纹病的主要手段。其中,戊唑醇是近年筛选出防治苹果轮纹病的重要化学农药品种,该药剂是德国拜耳公司于20世纪80年代开发的三唑类杀菌剂,90年代中期开始在中国苹果树上登记使用。该杀菌剂属于一种广谱、低毒、内吸性杀菌剂,其作用机理主要是干扰病菌菌丝的形成,应用广泛。由于其作用位点单一,长期使用易使病原菌产生抗药性。现已有戊唑醇抗药性风险的研究报道,如Ma等监测出引起阿月浑子发病的B.dotidea。对戊唑醇的敏感性有所降低;用含戊唑醇的PDA平板培养基对禾谷丝核菌进行逐代处理得到了抗药性菌系,表明戊唑醇田间防治该菌具有较大的抗药性风险。迄今,应用戊唑醇防治苹果轮纹病已超过10 a,可能有潜在抗药性风险。我们旨在通过采集中国山东省不同地区的苹果轮纹病菌菌株,评价苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的抗药性现状,为苹果轮纹病菌的抗药性治理及制定正确防控策略提供基本理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
2007～2008年分别从山东省济南、烟台、威海、淄博等17个地区苹果园采集典型轮纹病病瘤和病果样本300余份。经组织分离、纯化及鉴定,保存菌株272个。挑选71个典型菌株,评价病菌对戊唑醇的敏感性。2009年从未施过戊唑醇的海棠上获取5个野生轮纹病菌菌株,作为参照菌株。
1.2 供试药剂
95%戊唑醇(tebuconazole)原药,江苏丰登农药有限公司生产。用少量丙酮溶解后加入0.1%吐温80水溶液,配成浓度为1000 mg·L-1的母液。
1.3 方法
1.3.1 含戊唑醇的PDA培养基制备用Eppendoff微量移液器吸取1mL的戊唑醇母液,用灭菌去离子水配成系列稀释液。将溶化的PDA培养基冷却至45℃,再用微量移液器分别将上述稀释液加入49 mL的PDA培养基中,配成终浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg·L-1的含药培养基平板。
1.3.2 生长速率法在PDA培养基上将病原菌培养5 d,自菌落边缘打取6 mm的菌饼,用接种针将菌饼接种于含药平板中央,置于26℃培养箱中,培养5d测定菌落生长量。设不含药剂处理为空白对照,每处理重复3次。
1.4 数据统计与分析
采用十字交叉法垂直测量菌落直径各1次,求其平均值,减去6mm菌饼直径,即为菌落生长直径。再根据3次重复的实验结果,求出各浓度梯度的平均直径,计算不同浓度梯度的菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率(%)=空白对照菌落生长直径-药剂处理菌落生长直径/空白对照菌落生长直径×100
用各浓度对数值及相应的菌丝生长抑制率几率值作回归分析,计算戊唑醇对不同苹果轮纹病菌菌株的EC50/EC90值和相关系数。
2 结果与分析
采用菌丝生长速率法测定了71个苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的抗药性状况,结果表明戊唑醇对苹果轮纹病菌的菌丝生长具有明显的抑制效果。ECso处于0.024 7～0.498 0mg·L-1,EC90处于0.5805～9.448 9 mg·L-1。根据ECso极差R=maxX-minX=0.498 0～0.024 7=0.473 3 mg·L-1,将处于0～0.5的EC50数据分成10组,具体分组的中值、频数见图1。
戊唑醇对不同苹果轮纹病菌菌株ECso的频数分布图呈现双峰曲线,不符合正态分布,这表明苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的敏感性已产生了分化。84.51%的菌株集中位于图1主峰范围内,其EC50平均值为0.111 5±0.048 5 mg·L-1:戊唑醇对5个野生海棠轮纹病菌菌株的EC50值也均分布在主峰范围内,其平均值为0.1053±0.0138mg·L-1(表1)。与野生海棠轮纹病菌菌株的ECso相比可知,多数苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇仍表现敏感性,可将EC50平均值0.1115±0.048 5 mg·L-1作为苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性基线。处于图1曲线次峰位置的11个苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的敏感性有所降低,表现出2～5倍的低水平抗药性。
在山东省,产生低水平抗药性的苹果轮纹病菌菌株主要分布于东营、威海、青岛、潍坊、日照、烟台等东部的6个地市(表2)。其中东营抗药性菌株比率最高,达66.67%;其次为威海和青岛,比率分别为37.50%和30.00%;潍坊、日照、烟台三地各出现1株抗药性菌株。尽管目前苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的抗药性水平较低,抗药性菌株分布不普遍,但抗药性菌株出现预示着戊唑醇防治苹果轮纹病具有一定的风险性。
3 讨论
苹果轮纹病是我省乃至全国苹果产区的一种常见病害,主要侵染果实和枝干,影响果实产量和树势强弱,甚至在干旱等极端环境条件下可导致当年结果枝条或来年结果枝条的大量死亡,造成苹果产业较大的经济损失。化学药剂仍是防治苹果轮纹病的主要措施。本文选取目前防治苹果轮纹病广泛应用的戊唑醇,评价了病菌对其的敏感性。
戊唑醇在结构上与三唑醇、三唑酮相似,但其在安全性、使用范围等方面比三唑醇、三唑酮又有提高。目前,在田间仍未见苹果轮纹病对戊唑醇产生抗药性的报道,但本研究表明,苹果轮纹病菌已对戊唑醇产生了敏感性分化。15.49%的苹果轮纹菌株产生了2～5倍的低水平抗药性,且主要分布于山东东部区域。戊唑醇自上世纪90年代中期开始在我国登记使用,起初因其价位高,制约了该杀菌剂的应用推广。但在我省东部区域90年代后期已在高经济效益的苹果上开始应用,因其防效良好,进入21世纪后才得以在我省迅速应用,尤其山东东部区域应用普遍。因此,在我省东部区域苹果轮纹病菌面临着更大的选择压力,这可能是抗药性菌株分布于山东东部区域的主要原因。
Yoshimura等研究表明桃褐腐菌对戊唑醇表现敏感,未出现抗药性现象。应用多菌灵防治苹果轮纹病已有几十年的历史,李晓军等通过测定苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性。表明不同地理来源的苹
果轮纹病菌对多菌灵的敏感性仍处在较高水平,不存在明显差异,没有出现敏感性下降的抗药性亚群体。苏平等测定了山东省18个苹果轮纹菌株,发现不同菌株对戊唑醇敏感程度有所不同,但EC50无显著性差异,本文检测出低水平抗药性亚种群的结果与之有所不同,这可能与取样范围、数量有关,苏平等主要测定了烟威地区苹果轮纹菌株。而本文测定的71个苹果轮纹病菌菌株覆盖全省,更能体现出山东省不同地区的苹果轮纹病菌在戊唑醇选择压力下的敏感性分化特点。草炭疽病菌(Colletotrichumcereale)对4种甾醇脱甲基抑制剂(DMIs)丙环唑、腈菌唑、戊唑醇、三唑酮具有交互抗性,就苹果轮纹病菌而言,戊唑醇与其他三唑类杀菌剂是否存在交互抗性仍需进一步研究。
4 结论
研究结果表明,来自于山东省不同区域的苹果轮纹病菌菌株对戊唑醇的敏感性存在差异,大多数苹果轮纹病菌仍对戊唑醇表现较高的敏感性。但出现了低水平抗药性的亚群体,表明戊唑醇防治苹果轮纹病具有一定的风险性。目前抗药性处于较低的水平,应及早引起重视,加强戊唑醇与其他不同机制的药剂轮换交替使用,并与其他非化学防治措施相结合,在保证良好防效的基础上,延缓抗药性的产生和发展,从而延长此化学杀菌剂的使用寿命。
参考文献
[1]国立耘,李金云,李保华,张新忠,周增强,李广旭,王英姿,李晓军,黄丽丽,孙广字,文耀东,中国苹果枝干轮纹病发生和防治情况[J]植物保护。2009,35(4):120-123
[2]祈之秋,周明国,戊唑醇对小麦纹枯病菌的抑菌作用[J],农药学学报,2003,5(3):80-84
[3]周增强,冯桂馨,盂秀灵,张鹏举,戊唑醇及其复配剂防治苹果轮纹病的田间药效试验[J],中国农学通报,2003,19(1):114-116
[4]韩青梅,康振生,段双科,戊唑醇与叶菌唑对小麦赤霉病的防治效果[J]植物保护学报,2003,30(4):339-440
[5]李富根,吴新平,刘乃炽,戊唑醇的作用特点及其应用概况[J],农药利学与管理,2001,22(3):41-42
[6]MA z H,MOReAN D P,FELTS D,MICHAILIDES T Jsensitjvtyof Botryosphaeria dothidea from California plstachio to tebueonazole[J],CmpProtection,2002,21(9):829-835
[7]刘英华,王开运,姜兴印,仪美芹,王怀圳,禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性及抗药性菌系生物学特性[J]植物保护学报,2003,30(4):423-428
[8]慕立义,植物化学保护研究方法[M]北京:中国农业出版社,1994:142
[9]YOSHIMURA M A,LUO Y,MA Z H,MICHAILIDES T J Sensi—
tivity nf Monilinia frafructico from stone fruit to thiophanate-methyl,iprodione,and tebuconazole[J],Plant Disease,2004,88(4):373-378
[10]李晓军,范昆,曲健禄,张勇,王涛,亓彬,苹果轮纹病菌对多菌灵的敏感性测定[J],果树学报,2009,26(4):516-519
[11]苏平,周增强,侯珲,王丽,朱建兰,苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性检测[J],果树学报,2010,27(1):69-76