材料
Agilent 1200 高效液相色谱仪（VWD检测器）；HL-2 恒流泵（ 上海沪西分析仪器厂）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；SZ-93自动双重水蒸馏器（上海雅荣生化仪器设备有限公司）；IIIB循环水真空泵（浙江临海市精工真空设备厂）；SB3200超声清洗器（Shanghai Branson）；AB104-N 1/1万天平（梅特瑞-托利多仪器上海有限公司）；1/10万天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；微量移液枪（上海大龙医疗设备有限公司）。
丰城鸡血藤（丰城市科委提供并经江西中医学院赖学文教授鉴定为崖豆藤属鸡血藤）；刺芒柄花素（上海康九化工有限公司， 批号060819，纯度98%）；乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司，批号T20110214）；维拉帕米（中国食品药品检定研究院，批号100223-200102）；甲醇（色谱纯，上海星空生化有限公司）；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）为化学纯，液相用水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
Kreb-Ringer′s营养液（K氏液，每1 L含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaH2PO4 0.32 g，NaHCO3 1.37 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g）；
雄性SD大鼠，体重（200±25） g，江西中医学院清洁级动物中心提供，合格证号SCXK（赣）2005-0001。
2 方法与结果
2.1 异黄酮类成分的提取
丰城鸡血藤用30倍量60%乙醇回流提取3次，每次40 min，将提取液浓缩，得稠膏，加2倍于药量的水溶解，过滤，滤液蒸去乙醇，加水使成每毫升含1 g生药的溶液。将溶液上AB-8型大孔树脂，充分饱和后，用90%乙醇0.8 mL·min1的流速洗脱有效成分，洗脱液浓缩后减压干燥，得丰城鸡血藤中主要异黄酮类成分（刺芒柄花素质量分数为0.25%）。
2.2 刺芒柄花素的测定
2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸水（65∶35），以微孔滤膜过滤并经超声脱气处理；检测波长249 nm；流速1.0 mL·min1；柱温25 ℃；进样量20 μL。
2.2.2 对照品的配制 精密称取刺芒柄花素对照品10.08 mg，置于10 mL量瓶中，用含有0.5%吐温-80的K氏液溶解稀释至刻度，摇匀，制得质量分数为1.008 g·L-1的刺芒柄花素对照品储备液。
2.2.3 线性关系的考察 分别精密量取刺芒柄花素储备液0.01，0.02，0.04，0.08，0.1，0.2，0.4，0.8，1 mL置10 mL量瓶中，用含有0.5%吐温-80的K氏液溶解稀释至刻度，配置成1.01，2.02，4.032，8.064，10.08，20.16，40.32，80.64，100.80 mg·L-1的系列对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液20 μL进样，记录峰面积，以质量浓度（C）为横坐标，以刺芒柄花素峰面积（A）为纵坐标，采用Excle二元线性回归得回归方程Y=28.041X-57.014（r=0.998 6），表明刺芒柄花素在1.01～100.80 mg·L-1线性关系良好，见图1。
2.2.4 精密度试验 精密称取刺芒柄花素对照品适量，用空白肠灌流液稀释得高、中、低（10.08，20.16，40.32 mg·L-1）3个质量浓度的对照品溶液，于1 d中不同时间取样，测定5次试验结果计算精密度。计算得刺芒柄花素峰面积的RSD分别为3.01%，2.22%，1.93%，结果表明该方法的精密度良好。
2.2.5 稳定性试验 分别用K氏液和空白肠灌流液配置100.80 mg·L-1的刺芒柄花素溶液各3份，37 ℃水浴孵育6 h，分别于1，2，3，4，5，6 h取样，进行HPLC分析，计算刺芒柄花素峰面积的RSD分别为1.8%，1.7%，1.5%。表明在37 ℃水浴中放置6 h，刺芒柄花素在灌流液中6 h内稳定。
2.2.6 回收率试验 精密称取刺芒柄花素对照品适量，用空白肠灌流液稀释得高、中、低（10.08，20.16，40.32 mg·L-1）3个质量浓度的对照品溶液，进样20 μL，测定3次，根据2.2.3中回归方程得实测浓度，以实测浓度与理论浓度之比计算回收率。结果表明，刺芒柄花素高、中、低3种浓度的回收率分别为98.21%，99.01%，101.40%，结果表明该方法的回收率良好。
2.3 大鼠在体肠单向灌流实验
2.3.1 手术方法 选取实验前禁食18 h（自由饮水） 的大鼠， 腹腔注射20%乌拉坦溶液麻醉并固定，用红外灯保持37 ℃体温，沿腹中线打开腹腔3 cm结扎胆总管，按以下方法取肠道各段，在两端剪切后插管，并用线扎紧。十二指肠段自幽门1 cm处开始，空肠段自幽门15 cm处开始，回肠段自盲肠上行20 cm处开始，结肠自盲肠后端开始，各段均取10 cm。以5 mL·min1流速用37 ℃ K氏液冲洗肠管内容物至净，将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿。将大鼠肠道连接到灌流装置。
2.3.2 操作方法 取预热至37 ℃的供试液以0.3 mL·min1流速灌流30 min，平衡管路及肠段，并开始计时，进液口用已知质量的装有灌流液的小瓶灌流，出液口处用另一已知质量的小瓶收集流出液，每隔15 min迅速更换一次灌流液小瓶和收集液小瓶，称重，测出刺芒柄花素的质量浓度，实验持续时间为75 min（15 min×5）。处死大鼠，测出肠道内径与长度。
2.3.3 数据处理 采用重量法计算药物吸收速率常数（Ka）和表观吸收常数（Papp）。
Ka=（1-CoutQout/CinQin）Q/V
Papp=〔-Q·ln（CoutQout/CinQin）〕/2πrl
其中，Qin和Qout分别为肠段灌入的灌流液和收集液的体积（mL）（假定灌流液和收集液的质量浓度均为1.0 g·mL-1），l和r分别为灌流肠段的长度（cm）和横截面半径（cm），Q为灌流速度，Cin和Cout分别为灌流液收收集液的浓度（mg·L-1），V为灌流肠段的体积（cm3）。根据Grubbs检验法对每隔肠段获得的若干个Ka和Papp分别进行偶然误差值的取舍，取舍后必须保证至少有3个以上的Ka和Papp无显著误差，计算其平均值，即得Ka和Papp。
2.4 灌流液中刺芒柄花素质量浓度对药物肠吸收的影响
取24只大鼠随机分成4个浓度组，每组6只，以十二指肠为灌流部位，分别以含有刺芒柄花素质量浓度为1.996，9.98，49.9，100.2 mg·L-1的丰城鸡血藤异黄酮提取物灌流液（均以0.5%吐温-80配制）灌流，灌流速度为0.3 mL·min1，每个质量浓度的灌流液持续灌流75 min，每次换液前用下一质量浓度的灌流液平衡肠段，按大鼠在体肠单向灌流实验方法操作，计算不同质量浓度刺芒柄花素在十二指肠中吸收的Ka和Papp，结果见表1。刺芒柄花素在2～100 mg·L-1的灌流液中，其在十二指肠段的Ka和Papp均无显著性差异，表明刺芒柄花素在十二指肠中的吸收在此浓度范围内不受质量浓度影响。
2.5 灌流液中刺芒柄花素在不同肠段的吸收考察
取24只大鼠随机分成4个肠段组，每组6只，均以含有刺芒柄花素质量浓度9.98 mg·L-1的丰城鸡血藤异黄酮提取物灌流液（以0.5%吐温-80配制）灌流，灌流速度为0.3 mL·min1，持续灌流75 min，按大鼠在体肠单向灌流实验方法操作，计算刺芒柄花素在各肠段的Ka和Papp，见表2。刺芒柄花素在小肠段（十二指肠、空肠和回肠）的Ka显著大于在结肠处的值，但小肠各肠段间Ka无显著性差异；其在不同肠段Papp无显著性差异，表明刺芒柄花素在全肠道吸收较好，吸收部位主要在小肠，且在小肠内无明显的特定吸收部位。
2.6 P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对刺芒柄花素肠吸收的影响
取48只大鼠，随机分为未加抑制剂组和加抑制剂组，每组24只，再将每组分为4个肠段组，每组6只。配制含有刺芒柄花素质量浓度9.98 mg·L-1的丰城鸡血藤异黄酮提取物灌流液（A），另配制含有维拉帕米49.107 mg·L-1的A灌流液（B）（均以0.5%吐温-80配制），分别用这2种灌流液灌流不同肠道，灌流速度为0.3 mL·min1，按大鼠在体肠单向灌流实验方法操作，先用灌流液A灌流，持续75 min，更换灌流液前先用灌流液B平衡肠道，然后采用灌流液B灌流，分别计算2种灌流液中刺芒柄花素在各肠道的的Ka和Papp，见表3。加入P-gp抑制剂维拉帕米后，灌流液中刺芒柄花素在各肠段的Ka和Papp均发生显著性变化（P<0.05）。说明P-gp抑制剂维拉帕米的存在对刺芒柄花素的肠吸收影响较大，能够明显促进其吸收。
3 讨论
因刺芒柄花素在水中溶解度较小，所以加入表面活性剂吐温-80增溶，为保证实验的平行性，所有对照品溶液和灌流液均含有0.5%吐温-80。目前国内大多采用检测设备较简单的在体循环法评价药物的肠吸收，但因该法时间（4～6 h）以较高流速（2～5 mL·min1）回流供试液，易造成对肠黏膜损伤，导致药物的吸收增大，使测得值与真实值产生较大偏差[8-10]。而国外大多数采用单向灌流法，以较低流速（0.2～0.3 mL·min1）对某一肠段进行单向灌流，小流速可以减少灌流过程中对肠壁的损伤[9-10]，再根据灌流液和收集液中的药物质量浓度差考察药物在该肠段的吸收，同时单向灌流法的实验条件和口服给药后药物接触的肠道环境较为接近。
在体肠循环法中，即使选用肠道不吸收的酚红作为标记物，由于时间较长，酚红也难免有一定程度的肠吸收，同时，酚红本身也有干扰某些被测物质在肠道的吸收和测定。重量法由于不涉及“标记物”的测定，避免紫外测定法给实验结果带来的误差，与传统酚红法相比大大减少了工作量，数据更准确，因此，本实验采用了该法进行实验研究。
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Study on intestinal absorption of formononetin in Millettia nitita
var. hirsutissima in rats
LIU Ya-li1， 2， XIONG Xian-bing3， SU Dan1， SONG Yong-gui1， ZHANG Ling1*， YANG Shi-lin1
（1. National Engineering Center for Solid Preparation of Traditional Chinese Medicine，
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；
2. College of Pharmacy， Suzhou University， Suzhou 215123， China；
3. Department of Medical Instrument， No.94 Hospital of PLA， Nanchang 330002， China）
[Abstract] To use the single-pass intestine perfusion （SPIP） model and HPLC to determine the concentration of formononetin， the effect of quality concentrations of formononetin， different intestinal segments and P-glycoprotein inhibitor on intestinal absorption of formononetin， in order to observe the intestinal absorption mechanism of formononetin from Millettia nitita var. hirsutissima in rats. The experimental results showed that the qulaity concentration of formononetin in the perfusate had no significant effect on the absorption rate constant （Ka） and the apparent absorption coefficient （Papp）； Ka and Papp of formononetin in duodenum， jejunum and ileum showed no significant difference. However， Ka was significantly higher than that in colon （P<0.05）， with significant difference between that in intestinum tenue and colon. P-glycoprotein inhibitor verapamil showed significant difference in Ka and Papp in intestinal segments （P<0.05）. This indicated that the absorption mechanism of formononein in rat intestinal tracts passive diffusion， without any saturated absorption. Formononein is absorbed well in all intestines. Their absorption windows were mainly concentrated in the intestinum tenue， without specific absorption sites. Formononein may be the substrate of P-glycoprotein.
[Key words] formononein； single-pass intestine perfusion； gravimetric method； absorption rate constant； apparent absorption coefficient
doi：10.4268/cjcmm20132032