摘要： 该研究以扬州地区成年杉木为材料，采用半薄切片法以及扫描电镜和透射电镜观察法，对杉木花粉发育过程进行了观察。结果表明：杉木的造孢细胞形成于10月，持续至翌年的1月底至2月初。造孢细胞位于小孢子囊最里面，呈多边形，数量多且彼此排列紧密；细胞壁很薄，细胞核较大，内含丰富的细胞器和脂类物质。造孢细胞发育成熟后彼此分离形成小孢子母细胞。小孢子母细胞的减数分裂开始于2月下旬，经两次减数分裂，先后形成二分染色体和四分染色体。小孢子从四分体释放后，体积迅速增大，发育形成花粉，这个过程中，伴随着明显的营养物质变化。杉木成熟花粉壁由薄壁区和厚壁区两部分组成，薄壁区中央有一个乳头状突起，突起上有一萌发孔。成熟花粉外壁着生了许多瘤状颗粒。该研究结果为杉木生殖发育、有性繁殖以及系统演化研究提供了重要依据。
关键词： 杉木， 花粉， 小孢子， 造孢细胞， 散粉
中图分类号： Q944， S791.27
文献标识码： A
文章编号： 10003142（2017）10134206
杉木（Cunninghamia lanceolata），在传统分类上属于裸子植物门（Gymnospermae）杉科（Taxodiaceae），由于近年来国际学术界已将杉科并入广义柏科（Cupressaceae），所以杉木现属于柏科的杉木亚科（Cunninghamhioideae）杉木属（Cunninghamia） （Mao et al， 2012）。该属仅有1种1变种（于永福， 1995）。杉木是我国长江以南地区最主要的造林用材树种之一。目前，全国杉木人工林面积为911×104 hm2，占全国和世界人工林总面积的18%和5%（万晓华， 2013）。因此，杉木在我国造林树种中占有重要地位。
花粉又称为小孢子，是种子植物特有的结构。由于裸子植物大都是风媒传粉（王莉等， 2015），裸子植物花粉生长发育与形态结构，与传粉、受精等有性生殖密切相关（Lu et al， 2016）。杉木花粉形态及花粉管生长形态已有相关报道，如席以珍（1986）和傅远志（1994）发现杉木花粉粒的形状属球形或近球形，萌发孔形状多样，花粉壁较薄。张卓文（2003）测定了杉木各无性系花粉大小、花粉萌发、花粉生活力以及花粉培养基等。徐进等（2007）观察了杉木花粉母细胞在减数分裂时期单价体和多价体、染色体桥、滞后染色体、不均等分离、微核等异常细胞学行为。还有研究报道了杉木的花粉管中存在循环微丝束、微管的分布方式（甘国峰等， 2011， 2012）。尽管前人已对杉木花粉粒的形态和结构进行了一些研究，但花粉在整个发育过程中的形态结构变化，以及适应传粉特征目前尚不清楚，而这些是研究杉木授粉和有性生殖的重要基础。因此，本研究从细胞学角度，研究观察了杉木造孢细胞的超微结构、小孢子发生过程、花粉发育过程中营养物质变化以及成熟花粉的形态特征，为进一步研究杉木传粉生殖生物学提供基础资料。
1材料与方法
1.1 材料
试验所用杉木取自江苏省扬州市瘦西湖风景区（32°24′ N， 119°25′ E）内，杉木生长发育良好。于10月小孢子叶球出现至第2年4月散粉期间，对同一株杉木连续取样，采集的小孢子叶球用戊二醛和FAA固定液固定后置于4 ℃冰箱中保存。
1.2 方法
1.2.1 半薄切片观察法将定期取样的杉木小孢子叶球浸入戊二醛固定液中固定后置于4 ℃冰箱中保存。样品取出后，用磷酸缓冲液清洗3次各15 min，之后进行梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水处理各15 min，乙醇与丙酮2∶1、1∶1、1∶2混合液脱水处理各15 min，纯丙酮脱水处理一次15 min，脱水处理后用spurr树脂浸透包埋。包埋后的样品修样后，用ULTRACUT E型超薄切片机切片，切片后用甲苯胺蓝染色后置于LEICA DMLS2型光学显微镜下观察并拍照。
1.2.2 扫描电镜观察法定期取样的小孢子叶球用FAA固定液固定，置于4 ℃冰箱中保存。冰箱中保存。样品取出后，用磷酸缓冲液清洗3次各15 min，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水处理各15 min，乙醇与丙酮1∶1混合液脱水处理一次15 min，纯丙酮脱水处理两次各15 min，丙酮与乙酸异戊酯1∶1、1∶2混合液脱水处理各15 min，纯乙酸异戊酯脱水处理一次30 min。脱水后在HCP2型临界点干燥仪上干燥，然后在SCD500型離子溅射喷镀仪上喷金，最后将样品置于S4800型场发射扫描电子显微镜下扫描并拍照。
1.2.3 透射电镜观察法将样品用戊二醛固定，经过PBS冲洗、锇酸后固定、PBS冲洗、乙醇脱水、树脂包埋等步骤后，用Leica EM UC6型超薄切片机切成100 nm的薄片，铜网捞片、烤片，醋酸铀和佐滕氏铅混合液双重染色，在CM100型投射电子显微镜下观察并拍照。
2结果与分析
2.1 小孢子形成的解剖结构观察
10月中旬， 造孢细胞已经形成，此时造孢细胞排列紧密，细胞壁薄（图版I： A）。11月中旬，造孢细胞细胞核明显，少部分造孢细胞开始瓦解，为其他造孢细胞的发育提供空间和营养成分（图版I： B）。随后，造孢细胞彼此分离，形成游离状的小孢子母细胞，小孢子母细胞具有较大的细胞核（图版I： C）。小孢子母细胞形成之后，2月下旬，细胞的减数分裂开始，经过两次减数分裂，形成二分染色体（图版I： D）和四分染色体，新形成的四分体小孢子呈四角型，此时小孢子还未从四分体中释放，每个小孢子呈三角状，细胞内细胞器丰富（图版I： E）。从四分体释放后，小孢子体积迅速增大，细胞壁增厚，细胞质有明显的液泡化现象（图版I： F）。
2.2 小孢子形成的超微结构观察
杉木的造孢細胞形成于10月，结束于第二年的1月底至2月初，持续近4个月。造孢细胞形成后，位于小孢子囊的中部，细胞数量多，呈多边形，彼此排列紧密（图版I： GH）。造孢细胞的细胞核较大，是细胞内的主要部分，核仁中染色质浓缩（图版I： I）。同时，造孢细胞的细胞壁较薄（图版I： J），内含有丰富的细胞器和脂类物质（图版I： K）。此外，造孢细胞处于活跃分裂中，可观察到一些细胞具有两个核仁（图版I： L）。造孢细胞发育成熟形成小孢子母细胞，小孢子母细胞减数分裂形成小孢子。小孢子内含有高尔基体、线粒体等细胞器（图版I： M）。小孢子液泡化时期，中央形成大液泡，细胞核被挤至细胞边缘（图版I： N）。小孢子发育后期，细胞壁增厚，壁外形成许多乌氏体（图版I： O）。
2.3 花粉发育过程中营养物质的积累
杉木花粉发育过程中，有明显的营养物质变化规律。1月底，在花粉细胞中可观察到仅有少量的淀粉粒，细胞核较大（图版Ⅱ： A， G）。2月上旬，小孢子不断发育，细胞内的淀粉粒数量逐渐增多，细胞排列相对集中（图版Ⅱ： B， H）。2月中旬，淀粉粒逐渐趋于成熟，体积进一步增大，周围出现液泡化现象，细胞数量显著增加（图版Ⅱ： C， I）。2月下旬，花粉细胞内的淀粉粒最明显，细胞壁增厚（图版Ⅱ： D， J）。3月上旬，花粉细胞内部分淀粉粒解体，数目开始变少（图版Ⅱ： E）。3月中下旬，花粉发育成熟，细胞内的淀粉粒数目明显减少（图版Ⅱ： F）。
2.4成熟花粉的形态特征
3月中旬，杉木的花粉发育成熟，扁圆球形的花粉较均匀的散布在小孢子囊中，每个成熟花粉的直径约为20 μm （图版Ⅱ： K）。花粉壁由两部分组成，分别为处于上部的薄壁区和处于下部的厚壁区（图版Ⅱ： L， M）。薄壁区中央常有一突起，突起物顶端有一个小孔，即为萌发孔，为以后花粉管长出的区域（图版Ⅱ： N， O）。此外，花粉外壁着生了许多小颗粒瘤状突起，数目及密集程度不等，为颗粒状纹饰（图版Ⅱ： P）。
3讨论
造孢细胞是由孢原细胞有丝分裂后形成的一类具有分生能力的细胞。前人研究表明，杉木的造孢组织具有一般分生组织的特征，但核仁呈不规则分枝状，细胞呈多角形；小孢子母细胞之间具胞间隙，细胞质膜和细胞壁之间有胼胝质，核仁呈不规则块状，细胞呈圆形（蒋恕和黄金生， 1988）。在本研究中，扬州地区杉木花粉的发育过程可分为四个阶段，第一阶段为10月中旬或者更早，持续至翌年的2月，此时是造孢细胞的形成阶段。通过对造孢细胞的超微结构观察发现：其数量多，细胞呈多边形，彼此排列紧密，细胞壁很薄。第二阶段为2月上中旬，此时是造孢细胞减数分裂间期，我们观察到造孢细胞的细胞核明显变大，表明染色体正在核内复制准备减数分裂，其中含有丰富的细胞器。第三阶段为2月下旬至3月上旬，造孢细胞经过冬季休眠发育成熟，春季解除休眠后进入减数分裂期，形成小孢子。通过对造孢细胞减数分裂过程的半薄切片观察，也发现杉木的四分体排列方式大多为四角型的排列方式，这一结果与徐进等（2007）的研究结果相似。杉木造孢细胞的减数分裂过程与如欧洲赤松（Pinus sylvestris）、欧洲云杉（Picea abies）、白云杉（P. glauca）和油杉（Keteleeria fortunei）的造孢细胞经减数分裂形成四分体的过程相似（李国平和黄群策， 2006），都是经过冬季休眠而后在春季解除休眠后进行减数分裂。第四阶段为3月中下旬，此阶段是杉木花粉发育成熟的过程。整个花粉发育过程中，营养物质特别是淀粉的积累呈现先增加后减少的趋势。淀粉的积累是为花粉母细胞的减数分裂提供物质基础，所积累的淀粉在减数分裂过程中大部分被花粉粒迅速转化、吸收和利用。
A. 10月中旬，造孢细胞排列紧密，细胞核不明显； B. 11月中旬，造孢细胞有明显的细胞核； C. 1月下旬至2月上旬，呈游离状的小孢子母细胞； D. 减数分裂形成的二分体小孢子； E. 减数分裂形成未分开的四分体小孢子； F. 从四分体释放后的小孢子呈松散结构，细胞核大，质浓； GH. 造孢细胞； I. 造孢细胞的分枝状核仁； J. 造孢细胞间的细胞壁； K. 造孢细胞内的细胞器和脂类物质； L. 造孢细胞正处于活跃的细胞分裂； M. 小孢子内的细胞器； N. 小孢子液泡化时期； O. 小孢子发育后期。 SC. 造孢细胞； N. 细胞核； MMC. 小孢子母细胞； DY. 二分染色体； Te. 四分染色体； Va. 液泡； Ms. 小孢子； Nu. 核仁； W. 细胞壁； Ve. 小泡； L. 脂类； M. 线粒体； Di. 高尔基体； U. 乌氏体。 比例尺： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm。
Plate ⅠAnatomic and ultrastructural observation of microsporogenesis and microspore development in Cunninghamia lanceolata
A. In midOctober， sporogenous cells were arranged closely； B. In midNovember， the sporogenous cell had an obvious nucleolus； C. In late January to early February， microspore mother cells were separated each other； D. Dyad formation after meiosis； E. Tetrad formation after meiosis； F. The microspore released from tetrad with a large nucleus and thick cytoplasm； GH. Sporogenous cell； I. Sporogenous cell with a branching nucleolus； J. Cell wall between sporogenous cells； K. The organelles and lipids in sporogenous cells； L. The active sporogenous cells； M. The organelles in microspore； N. Microspore vacuolization； O. Microspores in late development stage. SC. Sporogenous cell； N. Nucleus； MMC. Microspore mother cell； DY. Dyad； Te. Tetrad； Va. Vacuole； Ms. Microspore； Nu. nucleolus； W. Wall； Ve. Vesicle； L. Lipid； M. Mitochondria； Di. Dictyosome； U. Ubisch body. Scale bars： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm.
A. 1月底花粉细胞； B. 2月上旬花粉细胞； C. 2月中旬花粉细胞； D. 2月下旬花粉细胞； E. 3月上旬花粉细胞； F. 3月中下旬花粉细胞； G. 1月底花粉细胞超微结构； H. 2月上旬花粉细胞超微结构； I. 2月中旬花粉细胞超微结构； J. 2月下旬花粉细胞超微结构； K-M. 成熟的花粉细胞； N-O. 花粉细胞萌发孔； P. 花粉细胞外壁。 P. 花粉粒； S. 淀粉粒； N. 细胞核。比例尺： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm。
Plate ⅡPollen development process and ultrastructure of mature pollen in Cunninghamia lanceolata
A. Microspore in late January； B. Microsporein early February； C. Microspore in midFebruary； D. Microspore in late February； E. Microspore in early March； F. Microspore in late March； G. Ultrastructure of microspore in late January； H. Ultrastructure microspore in early February； I. Ultrastructure of microspore in midFebruary； J. Ultrastructure of microspore in late February； KM. Mature microspore； NO. Germinal aperture in microspore； P. Surface of microspore. P. Pollen； S. Starch； N. Nucleus. Scale bars： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm.
传粉是杉木有性生殖过程中不可缺少的环节（张卓文， 2005），裸子植物通常是风媒传粉植物，其花粉演化成了利于风媒传播的形态和结构特征（Lu et al， 2011； 张敏等， 2014； 王莉等， 2015）。针叶树的花粉直径在20～100 μm之间，并且花粉的含水量很低，通常在5%～10% （Owens et al， 1998）。贾子瑞等（2014）对云杉属20个种的花粉结构用扫描电镜进行了观察，发现花粉均属于两气囊松科花粉，大小为84.33～118.79 μm。张敏等（2014）对5种裸子植物花粉外壁进行了扫描电镜观察，发现杉木的花粉粒近扁球形，花粉粒体积小，在花粉极面有1个稍微突出的乳头状突起，外壁有疏松的颗粒状纹饰。本研究中，杉木花粉呈扁圆球形，直径约20 μm，属于较小的花粉，表面具颗粒状纹饰，花粉的轮廓线呈现波浪形，使得花粉的逸散更加容易。虽然不具有气囊，但其进入空气中之后立即失水，从而减轻了自身重量，有利于空气中漂浮。另外花粉薄壁区向下凹陷，使花粉形成空腔，从而增加了其在空气中的浮力。这些结果表明，杉木花粉的这些特点体现了其适应风媒传粉的特征。
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