RP—HPLC法测定冻干粉针中DHEA的含量

对照品（含量：99.90%，军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）；DHEA冻干粉针（含主药10 mg/瓶）及空白辅料（军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）。

2 冻干粉针制备

按照DHEA：甘露醇：吐温80=（12：5：2）投料比，将处方量甘露醇和吐温80置研钵中，少量滴加配制好PBS缓冲液（pH=6.0） ，研匀后采用少量递加法加入已研细DHEA粉末，研磨均匀，加入PBS缓冲液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混悬液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃预冻后，抽真空并缓慢将温度升至0℃升华干燥，保持一段时间，直至含水量达1%以下，得疏松状固体后，封口即可。

3 溶液制备

3.1 对照品溶液制备

取DHEA对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取对照品储备液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。

3.2 供试品溶液制备

称取供试品约14 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声5 min，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。 将供试品储备液用0.22 µm有机滤膜过滤， 精密吸取滤液2 mL至10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为供试品溶液。

3.3 空白溶液制备

精密称取与10 mg主药相当空白辅料，加乙腈超声5 min，并稀释至刻度，摇匀，过滤后取2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，即可。

4 色谱条件与系统适用性试验

采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈-水（55：45）；检测波长206 nm；流速1.0 mL·min- 1；进样量20 μL；柱温：室温。理论塔板数以DHEA算不低于5000。

按上述色谱条件，将对照品溶液、供试品溶液及空白辅料溶液分别进样，DHEA冻干粉针保留时间为10.06 min，空白辅料在此处无色谱峰出现，说明辅料对DHEA检测无影响。色谱图见图1。

5 方法学验证[10]

5.1 线性与范围

取对照品适量，配制成1.0 mg· mL- 1 对照品储备液，分别精密吸取0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL置10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，得一系列浓度标准溶液。取20 μL进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg· mL- 1）进行线性回归，得回归方程 A=1.0×107C+3.4×104，（n=6）（ r= 0.9998 ），结果表明，DHEA冻干粉针在0.01 mg· mL- 1～0.7 mg· mL- 1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

5.2 检测限、定量限

精密称取对照品适量，加乙腈超声溶解并稀释成一系列浓度进样，记录色谱图，在信噪比S/N=3时测得检测限为10 ng，在信噪比S/N=10时测得定量限为51 ng。

5.3 仪器精密度试验

取浓度为0.2 mg· mL- 1对照品溶液，连续进样6次，每次20μL，以峰面积计算，所得RSD为1.1%，表明仪器精密度良好。

5.4 重复性试验

取DHEA冻干粉针供10瓶，精密称定其装量，将倾出内容物混匀后，分别精密称取供试品9份，配制成低、中、高三种浓度，照“4”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算得平均标示量（%）为98.67%，RSD为0.42%。

5.5 稳定性考察

取供试品适量， 配制成0.1 mg· mL- 1、0.2 mg· mL- 1、0.3 mg· mL- 1 3种浓度，于配制后0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20 μL进样，照“3”项下色谱条件测定峰面积，结果24h内3种浓度峰面积RSD分别为1.87%、0.38%、1.03%，72 h 3种浓度峰面积RSD分别为1.49%、1.02%、1.50%，表明供试品溶液放置3天稳定，能够满足测定要求。

5.6 加样回收测定

精密称取供试品适量，6份，分别精密加入对照品适量，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2.0 mL至10 mL量瓶中加乙腈配制成含DHEA约0.2 mg· mL- 1加样溶液，摇匀，过滤后进样20 μL，测定回收率，结果（见表1）DHEA冻干粉针平均回收率为98.91%，RSD=0.43%。说明用本法测定DHEA冻干粉针含量准确度良好。

6 讨论

配制一定浓度对照品溶液，在190～800 nm范围内进行全扫描（见图2），可以看出本品为末端吸收，选择206 nm作为检测波长，既保证主药能有相应吸光值，又尽量远离溶剂截止波长。对于流动相，我们比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统，均能有很好分离，但乙腈截止波长为190 nm，相对来说比甲醇干扰更小，故选用乙腈-水系统作为流动相。冻干粉针中主药DHEA不溶于水，可溶于有机溶剂，但辅料为水溶性，采用纯有机溶剂提取，这就大大减少了辅料对其干扰，由液相色谱图也可以进一步验证，空白辅料对测定无干扰。

冻干粉针剂相对于水针剂质量更稳定，也更适合于给药剂量较小药物。DHEA为类固醇激素，给药剂量小，对多种疾病均有较好治疗作用，制成冻干粉针剂，不仅可以提高生物利用度，也可以相对降低潜在毒副作用，进一步增加了药物给药方式选择途径。

参 考 文 献

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[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）.北京： 中国医药科技出版社，2010： 附录194-195.

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