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摘 要 本文依靠近红外光谱技术对白茶进行总黄酮含量的快速判别。对91份来自不同厂家、不同年份和不同等级的白茶进行总黄酮含量的测定，并采集白茶近红外光谱图，运用TQ analyst 8.0软件进行分析，比较了不同光谱预处理方法，最终采用偏最小二乘法建立白茶总黄酮含量的定量模型。研究结果表明，所建立的总黄酮定量模型的相关系数为0.999 77，校正均方根差为0.043 5，验证均方根差为0.180，验证集平均相对误差为2.89%。该模型预测结果较好，能够准确、快速、无损地对白茶总黄酮含量进行定量分析。
关键词 白茶;总黄酮含量;快速测定;近红外光谱技术中图分类号 TS272.7 文献标识码 A
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.025
白茶为中国名茶，因其不炒不揉的独特工艺保留了茶叶原始的清香和甘爽的滋味，备受人们的喜爱[1]。黄酮类物质是多酚类中的重要组分，对茶叶感官品质、生理功能等起重要作用。在六大茶类中白茶的黄酮类物质含量最高，茶叶中的黄酮类物质不仅影响茶叶的滋味和色泽，也因其卓越的保健功效越来越受大众的关注[2]。大量研究表明黄酮类化合物在抗衰老、加强免疫力、预防癌症、降低高血压和糖尿病的发生率、抵抗病毒、抑制细菌的繁殖、抗疲劳、预防钙流失等方面有一定作用[3-9]。黄酮类化合物是白茶重要的品质成分，也是重要的保健成分，进一步加强对黄酮类化合物的研究对白茶品质研究和品牌推广有着重要意义。依靠近红外光谱技术能够快速准确地判别白茶中的总黄酮含量，极大地提高了检测效率，提高了生产效益，在生产实践中具有广阔的开发前景。
近红外光谱的范围在可见光与中红外光谱之间，近红外区域的主要信息来源于-CH、-NH、-OH等含氢基团的倍频和合频吸收，这些基团的基频吸收出现在中红外区，因此，绝大多数物质在近红外区域都有相应的吸收带，都能通过近红外光谱技术做定量分析。近红外光谱作为一种新型检测手段，在茶叶质量检测中发挥了越来越重要的作用。如王曼等[10]应用近红外光谱技术对黄山毛峰茶的鲜叶品质和等级做出快速判别，周小芬等[11]利用近红外光谱技术对大佛龙井茶的感官指标和品质指标进行快速预测，建立了科学准确的茶叶品质评价方法。此外，近红外光谱技术还在年份判别[12-14]、真伪检测[15-17]、品种检测[18-19]发挥着重要作用。
传统的茶叶物质中总黄酮的定量测定主要为三氯化铝比色法，但由于该方法前处理投入时间长，人员需求多，对实验结果的准确性和稳定性都有较大影响，不适合大量数据分析。近红外光谱技术能对样品进行快速无损的在线检测，耗时少，操作简便[20]。目前，利用近红外光谱技术对茶叶中品质成分的测定分析主要为茶多酚、氨基酸、咖啡碱、茶红素、茶黄素等，对白茶总黄酮含量测定鲜有研究。本研究将测定的总黄酮含量的真实值与其近红外光谱图相关联，通过化学计量法建立定量模型，以达到快速测定的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 材料：白茶茶样均采购于福鼎市内各大茶企，为2001—2017年生产的不同等级（白毫银针、白牡丹、寿眉）、不同厂家的茶样，共91个样品。为保证样品的差异性，取样时，每个批次作为1个样本。样品清单如表1所示。
试剂：氯化铝（批号：20100114），国药集团化学试剂有限公司;槲皮素对照品（批号：DST160928-028，纯度≥98%），成都德思特生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与设备 Antaris II 傅里叶近红外光谱仪（Thermo fisher scientific，美国），紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），BSA124S电子天平（Sartorius，德国），高速粉碎机（上海鼎广机械设备邮箱公司），电热烘干箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 近红外光谱的采集 取上述91份白茶茶样，粉碎后过80目筛，装袋密封。
测定方法：应用积分球固体采样模块，每个白茶样品粉末装样约13 g，摇晃样品杯，使得样品匀整紧密地放入样品杯中，并将样品杯底部擦拭干净，不得沾染茶粉，待测。分辨率8 cm–1，扫描次数64次，扫描范围10 000～4 000 cm–1，扣除背景，Gain选择2×，以空气作为参比，使用空调控制室温，恒定在25 ℃，采集白茶茶样近红外光谱图，每个样品重复3次，取平均值。
1.2.2 白茶总黄酮含量的测定 白茶总黄酮含量的测定采用三氯化铝比色法，参照袁华芳[21]的研究方法。黄酮类化合物与三氯化铝反应生成黄酮的铝络合物，并且茶叶中的黄酮类物质多以糖苷为主，因此可用槲皮素为基准物质做定量标准曲线，达到定量检测的目的。
以槲皮素为对照品，如图1可知，槲皮素在420 nm处有最大吸收峰，因此以420 nm作为测定波长，测定茶样在420 nm的吸光值，每個样品重复3次，取平均值，代入标准曲线计算白茶总黄酮含量。
1.2.3 化学计量法的选择 建立定量模型是近红外光谱分析中较为重要的一步，对于组成复杂的天然产物如中药、烟草、茶叶等通常可以使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）。PLS是基于因子分析的多变量校正方法，也是目前在近红外光谱技术领域中应用最多的多元校正方法，因此，本研究引入PLS作为建模方法。
1.3 数据处理
本研究运用Omnic 8.2软件进行数据格式的转换，用Origin 2017软件作图，用TQ Analyst 8.0软件进行光谱预处理和模型建立。
2 结果与分析
2.1 白茶近红外光谱图的采集
运用1.2.1的方法对91份白茶近红外光谱进行采集，样品近红外光谱叠加结果如图2所示。由图2可知，不同等级和年份的白茶光谱图虽然总体较为相似，但在高波长段的NIR吸收峰相对较强和尖锐，区分较为明显，这是由于不同白茶的品质成分虽然大致相同但是含量有所区别，导致吸收峰和峰型的差异。
2.2 总黄酮含量的测定
按照1.2.2测定91份白茶茶样的总黄酮含量，结果如表2所示。由表2可知，不同等级白茶总黄酮含量区别较为明显，寿眉总黄酮含量最高，其次是白牡丹，白毫银针含量最低。说明白茶黄酮含量与等级有着密切关联，等级越高，总黄酮含量越低。
采用PLS建立白茶总黄酮含量测定模型，运用TQ Analyst 8.0软件对模型进行优化和验证。从91份白茶样品中随机选取校正集和验证集，一般选择全部样品的2/3至3/4作为模型的校正集，剩下的为验证集，保证验证集的波动范围在校正集中，校正集和验证集的含量分布如表3所示。
2.3 光谱预处理方法的选择
因为白茶茶样的光谱相差不大，且受环境干扰较大，由检测器检测到的除了待测样品的信息外，还有各种干扰，如高频随机噪声、基线漂移、样品背景等，为了建立更加准确、精度更高的模型，需要采用相应的方法对光谱进行处理[22]。由于磨碎后的茶叶粉末颗粒大小、均匀性不同，光程无法保持恒定，一般选用多元信号修正（multiplicative signal correction，MSC）或标准正则变换
（standard normal variate，SNV）进行处理。此外还可以选择原始光谱，一阶导数光谱（first derivative，FD）或者二阶导数（second derivative，SD）进行光谱处理，一阶导数光谱能显示肩峰和吸收峰，而二阶导数光谱可以找出两者的准确位置。近红外光谱测定过程中，经常出现光谱飘移，通过导数处理一方面可以消除基线偏移，还可以放大和分离重叠信息。但是在导数处理过程中，噪声信号也被放大，因此，一般在积分处理前需要对光谱数据进行平滑处理。在TQ analyst 8.0软件中平滑处理方法为SG（Savitzky-Golay）平滑法与ND（Norris-derivative）平滑法，经过平滑处理后的光谱信噪比和稳定性都有了提高。以相关系数（R）、校正均方差（RESEC）、预测均方差（RESEP）为评判指标。R越接近1，白茶总黄酮含量的真实值和预测值越接近，相关性越好。RESEC和RESEP越接近0，则模型准确性越好。
通过比较不同的光谱预处理方法，最终得到的光谱经过SNV+SD+SG处理后建模效果最高，相关系数和校正均方差和验证均方差最接近最优值，不同预处理的结果如表4所示。
2.4 建模波段的选择
不同光谱区所包含的信息不同，光譜范围的选择是建立模型较为重要的一步。在近红外区域，光的散射效应和吸收强度随着波长而增加，而峰宽和穿透深度则相反，选择最适合的光谱区域需要考察近红外区域的光谱特征和白茶样品的物理性质等。由图3可知，10 000～8 000 cm–1光谱较为平滑，不同物质在此波段吸收峰差异较小，包含的信息较少，而8 000～4 000 cm–1区间内近红外光谱信息丰富，在此范围内有较多的可用价值。本研究采用SNV+SD+SG光谱预处理的方法建立模型，通过反复对比研究，以R和RESEC为参考内容，最终选用8 000～4 000 cm–1光谱区域进行研究。
2.5 主成分数的选择
主成分数的选择影响了模型的稳定性和准确性。本研究以交叉验证均方根误差（RMSECV）为判别标准，通过表5可知，当主成分数为14时，RMSECV的数值达到最小值，即0.261 96。因此，在本研究中，选择最优的主成分数为14。
2.6 异常样本的剔除
样品光谱或测定数据与真实值偏差太多视为异常样品，样品值异常可能为实验方法不当、样品存储不当或操作过程出现失误等原因导致。光谱异常可能是近红外光谱仪异常、环境变动和人为操作不当等原因导致。
91个白茶样品的总黄酮含量最大值为8.86 mg/g，最小值为1.72 mg/g，范围较广，覆盖了多年份、多等级的白茶，样本具有较好的代表性。本研究采用Dixon检验和光谱杠杆值与学生残差T检验的方法进行异常样本的剔除。
在化学计量学中，可以使用Dixon检验法对事先不知道测定值的均值和标准偏差，且测量得到的数据又服从正态分布的样品集进行异常样品的剔除。首先，将原始光谱信息通过主成分分析，减少其内部变量的含量（k<n），得到的新变量不仅保存了大部分原始信息且互不相关。通过主成分分析得到的k个新变量来计算实验样品光谱的马氏距离。样品光谱与样品集平均光谱之间的距离即为马氏距离，将得到的马氏距离通过Dixon检验法进行异常样品的剔除。将样本的马氏距离按照从低到高的顺序排列，图4显示并没有异常样品。
杠杆值表示样本对模型的影响程度，样本的杠杆值与相对应的总黄酮含量用学生残差T检验准则来表征，如果样本的光谱杠杆值和学生残差都超过了阈值，则表示该样本为异常样本，需要剔除。经计算得本研究的光谱杠杆值的平均值为0.21，杠杆值的阈值为它的2倍，因此设置为0.42。平均误差绝对值的平均值为0.87，学生残差的阈值为它的3倍，因此设置为2.61。由图5可知，样本1化学值正常而光谱值异常，并未发现两者都为异常的样本，所以本研究中91个样品都可作为建模样本。
最终运用TQ Analyst 8.0软件通过PLS建立模型，选取66份校正集、25份验证集作为实验样本。经过筛选，最终选用SNV+SD+SG作为建立模型的预处理方法，光谱范围为8 000～4 000 cm–1，主成分数为14，建立白茶总黄酮含量模型。本研究所建立的模型R=0.999 77，RESEC= 0.043 5，RESEP=0.180，RMSECV=0.261 96。以三氯化铝比色法测定的参考值与近红外模型测定的预测值相关图如图6所示，偏差图如图7所示。从图6中可以看出，白茶中近红外光谱模型预测值与真实值接近，模型判别性好。
2.7 模型的验证
对验证集的白茶茶样进行近红外光谱扫描，并导入所建立的白茶总黄酮定量模型中，将模型预测值与通过三氯化铝比色法测出的真实值进行对比分析，得出结果的平均相对误差为2.89%。说明建模效果较好，具有较高的可行性，结果如表6所示。
为了进一步验证模型的可靠性，对模型进行配对样本T检验。配对样本T检验是指对同一批茶样进行不同方式处理，以此来判别2种方法结果是否相同。设置置信水平为95%，p双尾= 0.889> 0.05，表明三氯化铝比色法测定的参考值与近红外光谱所测定的预测值差异不显著，2种方法无明显差异，近红外模型可较为准确地预测白茶总黄酮含量。
3 讨论
在目前依靠近红外光谱技术对茶叶成分进行快速测定已有的初步研究中，杨丹等[23]利用近红外光谱技术检测绿茶中的全氮量，建立了精确度高、稳定性好的绿茶全氮量近红外定量分析模型，同时建立了不同绿茶品种与嫩度等级的子模型，进一步提高了预测准确度。王玉霞等[24]采用偏最小二乘法进行优化分析，建立了绿茶茶汤中水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖、咖啡碱、儿茶素总量、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、没食子酸共11个指标或组分的近红外定量分析模型。王胜鹏等[25]建立了茶鲜叶的近红外光谱与其含水量、粗纤维总量和全氮量之间相关性模型，为茶叶鲜叶判别提供了新的技术手段。虽然近年来，近红外光谱技术在茶叶化学成分检测中的应用已有初步研究，但将近红外光谱技术与茶叶中总黄酮含量进行关联分析却较少报道。
本研究基于近红外光谱技术，采用PLS建立了白茶总黄酮模型快速鉴别方法，选用SNV+ SD+SG预处理方法，主成分数为14建立白茶总黄酮含量模型，所建立的模型R为0.999 77，RESEC为0.043 5，RESEP为0.180，p双尾为0.889。所建立的白茶总黄酮含量定量模型能够快速的对白茶总黄酮进行批量检测，提高了检测效率和精确度，建模效果好，在今后的研究中，还可以扩大样本量，增加模型的适用性和准确度，为白茶保健功效成分快速测定奠定基础。
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