摘要：研究乙酰氨基阿维菌素（Eprinomectin，EPR）原位凝胶注射剂体外释放度的测定方法，采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）测定EPR原位凝胶注射剂的体外释放度。结果表明，采用HPLC测定EPR原位凝胶注射剂体外释放度方法是可行的，体外释放曲线表明EPR原位凝胶注射剂有缓释的特点。以pH 7.4的PBS缓冲溶液作为释放介质的HPLC适用于EPR原位凝胶注射剂体外释放度的测定。
关键词：乙酰氨基阿维菌素；HPLC；原位凝胶注射剂；体外释放度
中图分类号：S859.79 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0095-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.024
Study on in Vitro Release of Eprinomectin in Situ Gel Injection
ZHANG Zhen-dong，LIU Xi-wang，MA Ning，SHEN Dong-shuai，LI Jian-yong
（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS/Key Lab of Veterinary Pharmaceutical Development，Ministry of Agriculture/Key Lab of New Animal Drug Project of Gansu Province，Lanzhou 730050，China）
Abstract： The purpose of this study was to determine the release of in situ gel injection of Eprinomectin in vitro （EPR）. The vitro release of EPR in situ gel injection was measured by high performance liquid chromatography（HPLC） using PBS buffer as a release medium. The results showed that it is feasible to determine the vitro release of EPR in situ gel injection by HPLC and the vitro release curve showed that EPR in situ gel injection had the characteristics of sustained release. This conclusion was that the HPLC method was suitable for the vitro release of EPR in situ gel injection with pH 7.4 PBS buffer solution as a release medium.
Key words： eprinomectin； HPLC； in situ gel injections； vitro release
乙酰氨基阿维菌素是由默克公司1997年开发出的大环内酯类体内外杀虫剂，是一种高效、广谱、低残留的兽用新一代抗寄生虫药物[1]。乙酰氨基阿维菌素具有广谱、高效、用量小和安全程度高等优点，对线虫、昆虫和螨虫均具有高效杀灭作用[2-4]。目前，国内商品化的制剂只有1% EPR注射液，为国家二类新兽药[5]。临床主要应用于奶牛、肉牛等动物，在羊、猪、兔等动物上进行的疗效试验也取得了较好的治疗效果，在其他动物上也有比较广泛的应用潜力[6]。但EPR注射液皮下注射给药，生物利用度低、药效维持时间短，从而给临床治疗效果带来严重影响。因此，提高生物利用度和延长有效血药浓度维持时间的EPR新制剂开发成为国内外防治寄生虫病的研究热点[7]。兰州畜牧与兽药研究所兽药研究室開发了一种EPR原位凝胶注射剂，拟用于奶牛、肉牛寄生虫病的治疗。本试验以PBS缓冲溶液作为释放介质，采用HPLC法对EPR原位凝胶注射剂的体外释放度[8]进行了方法学研究。
1 材料与方法
1.1 仪器和试药
Agilent-LC 1290II型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；CPA224S型电子天平（德国赛多利斯公司）；IS-RDV1型恒温振荡器（上海赛伯乐仪器有限公司）。
乙酰氨基阿维菌素标准品，B1a含量为95.4%，B1b含量为2.37%，批号K0471411，购自中国兽医药品监察所；EPR原位凝胶注射剂，批号170816；乙睛、甲醇，色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；磷酸盐缓冲溶液（1×PBS），北京索莱宝科技有限公司；叠氮化钠（DDN），山东西亚化学股份有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），国药集团化学试剂有限公司。
1.2 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温：35 ℃；流动相：乙腈∶甲酸水（0.1%的甲酸）=60∶40；流速：0.4 mL/min；紫外检测波长：245 nm；进样量：2 μL。
1.3 溶液的制备
1.3.1 标准品工作液的制备 精密称取乙酰氨基阿维菌素标准品102 mg，加无水乙醇定容至100 mL，制得浓度为1.02 mg/mL的标准品储备液。使用前用流动相稀释成系列浓度的标准品工作液。
1.3.2 供试品溶液的制备 EPR原位凝胶注射剂摇匀，用移液管精确量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用无水乙醇25 mL，分5次洗涤移液管内壁，洗液并入容量瓶中，摇匀，置水浴中超声10 min，加无水乙醇缓慢稀释至刻度，摇匀。精确量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
1.3.3 阴性对照液的制备 按处方比例精确称取EPR原位凝胶注射剂中除EPR原料药外的其他成分，同EPR原位凝胶注射剂工艺制备，再按供试品溶液的制备方法处理，即获得阴性对照液。
1.3.4 标准曲线的制备 精确量取标准品储备液适量加到流动相中，得浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL的标准品工作液，取2 μL进样测定，以峰面积（A）对EPR浓度（C）进行线性回归，计算线性回归方程。
1.4 精密度试验
取EPR标准品工作液，连续重复进样6次，进样量2 μL，依法测定峰面积，观察其峰面积测量值的相对标准偏差。
1.5 稳定性试验
分别在供试品溶液制备0、4、8、12、24 h后，精确量取2 μL，依法测定峰面积，考察其稳定性[9]。
1.6 加样回收率试验
精确称取EPR对照品和辅料适量，按处方制成EPR原位凝胶注射剂的样品，然后制备高、中、低3种浓度共9份供试品溶液，测定EPR浓度，与加入值进行比较，计算加样回收率。
1.7 EPR原位凝胶注射剂样品释放度的测定方法
将200 mg的EPR原位凝胶注射剂加入5 mL上述PBS缓冲液中，在恒温振荡器中振荡，振荡条件为50 r/min，37 ℃。分别于1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30 d将缓冲介质取出，加入5 mL新的缓冲介质，继续振摇。取释放介质2 μL进HPLC进行测定，并根据峰面积计算释放介质中的EPR浓度。释放度（%）=（释放介质中的EPR浓度×5 mL）/原位凝胶注射剂中EPR总量×100%。
2 结果与分析
2.1 色谱行为
阴性对照液、标准品溶液和供试品溶液的色谱见图1，EPR分离度良好，峰形尖锐，保留时间5.1～5.2 min，阴性对照液和供试品溶液中的其他组分对EPR的测定无干扰，方法专属性良好。
2.2 标准曲线
以峰面积（A）对EPR浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A=9 356.9C-3 041.6（r=1）线性范围1.562 5～200 μg/mL。
2.3 精密度结果
精密度试验结果见表1。RSD为1.48%（n=6），表明该仪器精密度符合要求。
2.4 稳定性结果
稳定性试验结果见表2。测定液室温放置24 h，与0 h比较含量无显著变化，RSD为0.26%，表明样品溶液在该试验条件下，可以稳定24 h。
2.5 加样回收率结果
加样回收率试验结果见表3，平均回收率为99.61%，RSD为0.47%（n=9）。
2.6 EPR原位凝胶注射剂样品释放曲线
对EPR原位凝胶注射剂按照上述方法进行体外释放度测定，以时间和累计释放量为坐标轴绘制释放曲线图2。结果表明，EPR原位凝胶注射剂有缓释的特点。
3 小结与讨论
EPR标准品溶液经紫外可见分光光度计扫描，在240～250 nm的波长处有吸收峰[10]。最初选择242 nm作为检测波长，在色谱条件优化时发现，当选择245 nm作为检测波长时，检测的灵敏度显著提高，故最终将检测波长定为245 nm。为避免EPR和注射剂中辅料的色谱行为相互干扰，筛选了甲醇-水、乙腈-水、丙二醇-水等流动相[11，12]，并根据色谱分离效果调整流动相组分的体积比，最终确定流动相为乙腈∶甲酸水（0.1%甲酸）=55∶45。在该色谱条件下，EPR与杂质分离效果良好，回收率、精密度、稳定性等试验结果进一步验证了试验所建立的方法专属性良好。在EPR原位凝胶注射剂体外释放度的测定过程中，使用恒温振荡器进行恒温振荡，其振荡条件为50 r/min以及使用PBS缓冲溶液作为释放介质都是为了更加真实地模拟动物体内环境[13]。EPR原位凝胶注射剂体外释放度测定方法学考察结果验证了该方法的可行性。EPR原位凝胶注射剂体外释放度测定结果表明，该剂型具有缓释、长效的特点。
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