摘要以菊苣叶为材料,利用丙酮、乙醚、石油醚、乙醇4种有机溶剂,采用冷浸和索氏提取法分别提取叶中的活性成分。然后以提取液为供试药剂,对苹果腐烂病菌、棉花枯萎病菌、葡萄白腐病菌、构巢曲霉病菌4种植物病原真菌进行离体活性测定。结果表明:丙酮、乙醚、石油醚的提取液对4种病菌均有不同程度的抑制作用,其中对葡萄白腐病菌抑制效果最好;乙醇的提取液对枯萎病菌具有一定的抑制作用。表明菊苣叶中存在抑菌活性成分,补充了菊苣抑菌活性的研究内容,为该种植物抑菌活性成分的研究和应用奠定基础。
关键词菊苣;生物活性物质;提取;抑菌作用
中图分类号 S636.9 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0076-02
StudyonAnti-microbialActivityoftheExtractsfromtheLeaves ofCichorium intybus
BAI Xue-feng 1WANG Hou-cheng 2ZHU Hui 3WANG Yan-ling 1WANG Peng 1LI Guo-qiang 1
(1 Agriculture Bureau ofTeng zhou,Tengzhou Shandong277500; 2 College of Earth and Enviromental Sciences Lanzhou University;
3 Coconut Research Instiute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences)
AbstractActive materials were extracted using acetone,aether,petroleum ether and ethanol by cold soaking and soxhlet extraction method. The anti-microbial activity of active materials against Valsa mail,Fusarium oxysporum,Coniothyrium diplodieua and Aspergillus nidulans were measured in vitro.The results showed that active materials extracted using acetone,aether and petroleum ether presented fungistasis to different extent on the four pathogenic fungi and had the best effect to Coniothyrium diplodieua.Active material extracted using ethanol presented certain anti-microbial effect to Fusarium oxysporum.The results also showed there were anti-microbial active material in the leaves of Cichorium intybus and founded a base on the research and application.
Key wordsCichorium intybus L.;bioactive substance;extraction;bacteriostasis
近年来,由于化学合成农药的广泛使用,产生了严重的“3R”问题,还带来了环境污染、生态平衡破坏和食品安全等一系列问题[1],而生物农药中的植物源农药因其低毒、低残留,符合现代环保和人们健康的要求,越来越受世界各国高度重视,掀起了一个研究开发植物源农药的高潮[2]。苏秀等[3]发现山核桃外果皮的提取物对黄瓜炭疽病、黄瓜菌核病等病菌有较强的抑制作用。崔彦等[4]发现五倍子、丁香、地榆的乙醇提取物对黄瓜细菌角斑病菌具较强的抑制效果。孟昭礼等[5]从银杏外种皮分离提纯出活性更高的化合物——白果酚,仿生合成出了一种新型抑菌剂“仿生安”,植物源抑菌剂的研究日益成为生物农药的研究热点。
菊苣(Cichorium intybus L)为菊科菊苣属多年生草本植物,栽培过程中极少有病虫危害,几乎不施任何农药化肥,食用安全,被称为21世纪的保健蔬菜[6]。近几年的研究表明,菊苣提取物不仅是菊粉、菊苣酸、果糖等的重要来源,而且其本身也具有许多生理活性,如增强免疫能力、抗炎作用、降低胆固醇和血糖等[7,8]。Ahmed B报道菊苣种子干粉甲醇提取物以及从甲醇部位分得的一酚类化合物AB-IV挥去溶剂后具有抗肝毒性的作用[9],叶国华等[10]报道菊苣在降低尿酸、甘油三酯的同时,还明显改善了血液流变学和纤溶系统活性。对菊苣提取物的报道大部分集中在对动物和人体本身的作用[11,12],在对真菌的效果上,仅徐雅梅报道过菊苣根提取物对小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌具有一定抑菌效果[13],而菊苣其他部分和其他新的靶标病菌国内外尚见未报道。笔者就菊苣叶的丙酮等4种有机溶剂提取液对苹果腐烂病菌等4种植物病原真菌的抑制作用进行了室内测定,初步确定了菊苣叶存在抑菌活性物质,有助于加深对菊苣抑菌活性的认识,为该类活性物质的研究提供理论基础和先导资源。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试样品。供试品种为普那菊苣(Cichorium intybus L),在其生长期采集叶片,自然阴干,将阴干的菊苣叶用粉碎机粉碎制成植物干粉,置于冰箱中(0～4℃)保存。
1.1.2培养基与试剂。真菌培养基为PDA培养基;石油醚、丙酮、乙醇、乙醚等生化试剂均为市售分析纯。
1.1.3供试菌种。苹果腐烂病菌(Valsa mail)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodieua)、构巢曲霉病菌(Aspergillus nidulans),以上菌种均由滕州市植保站提供。
1.2试验方法
1.2.1冷浸法提取抑菌物质。各称取4份50g材料,分别加入4种溶剂浸泡。每份材料均浸泡3次,每次所用溶剂量分别为200mL、200mL、100mL,提取时间分别为48h、48h、24h,合并滤液,最后将其浓缩至10mL,置于冰箱中(0～4℃)保存,供抑菌测定用。
1.2.2索氏提取法提取抑菌物质。各称取4份50g材料,分别以4种溶剂在索氏提取器中提取,均浓缩至10mL,置于冰箱中(0～4℃)保存,供抑菌测定用。
1.2.3室内抑菌活性测定。采用生长速率法[14]进行病原菌的抑菌活性测定。取4种有机溶剂的提取浓缩液各1mL,分别与灭菌的30mL PDA培养基混合,倒入直径为6cm培养皿内制成带毒培养基,各处理重复3次,以加等量的有机溶剂为对照。用直径为4mm的打孔器在培养好的供试菌菌落边缘切下菌饼反接于培养皿内,25℃培养4d,用“十”字交叉法测量菌落扩展直径2次,以其平均数代表菌落的大小。抑菌率的计算公式如下:
纯生长量(cm)=菌落的平均直径-菌饼的直径
抑菌率(%)=[(对照纯生长量-处理纯生长量)/对照纯生长量]×100
2结果与分析
对菊苣叶进行冷浸和索氏提取的样品的抑菌试验结果分别见表1和表2。其中,待测液的浓度均为0.16g/mL(干样/毫升培养基)。抑菌试验结果表明,丙酮、乙醚、石油醚、乙醇的提取液对4种病菌均有不同程度的抑制作用。
由表1可知,冷浸法中4种提取液对4种病菌均有一定抑制作用,其中丙酮、乙醚、石油醚3种提取液对葡萄白腐病菌的抑制率分别为100.00%、76.26%、88.00%,显著高于其他病菌。乙醇提取液的抑菌效果较差。
由表2可知,在索氏提取法下,丙酮、乙醚提取液对供试病原真菌均有一定抑制效果,其中丙酮提取液的效果较好,对苹果腐烂病菌的抑菌率最高达到76.24%,差异极显著。而石油醚、乙醇提取液的抑菌效果较差。
对比表1和表2可知,2种方法制备的提取液抑菌效果明显不同,除葡萄白腐病菌外,利用索氏提取法制备的丙酮、乙醚提取液的抑菌效果普遍高于冷浸法的提取液。索氏提取法采用加热的方法,可以提高提取效率,缩短提取时间,同时获取较多的成分。但加热提取会使一些不耐热的活性物质丢失,造成一些成分的丢失。因此,采用2种方法,能够较全面地获取活性成分。对于葡萄白腐病,丙酮、乙醚、石油醚冷浸中的提取液的抑菌率均在75%以上,丙酮的索氏提取的提取液的抑菌率也超过50%,冷浸法的丙酮和乙醚提取液对葡萄白腐病菌的抑菌效果显著高于其他病菌。说明菊苣叶中可能存在对葡萄白腐病菌具有高活性的抑菌物质。通过方差分析对比不同溶剂还可以看出,索氏提取的丙酮提取液对苹果腐烂病菌的抑菌效果显著高于其他病菌,说明菊苣叶中可能存在对苹果腐烂病菌具有高活性的抑菌物质。
3结论与讨论
植物源农药具有低毒、低残留的优点,其开发利用是解决我国食品安全和农产品农药残留超标等问题的可行方法。同一植物的根、茎、叶、花、果和种子等不同部位,其抑菌活性亦不相同[15],因此可开发利用的具有抑菌活性植物资源丰富。本试验通过对菊苣叶部的提取物进行抑菌试验,发现菊苣叶中存在对葡萄白腐病菌、苹果腐烂病菌有较高抑制作用的活性物质,对今后新型抑菌剂的开发奠定了理论基础。试验中某些提取液对供试菌种有促进作用,可能是因为提取液中的某种成分对某种病原菌有促进生长的作用。试验中2种提取方法的效果有一定的偏差,有的甚至相反,可能由于植物中同时存在抑菌和促菌的活性物质[8],因提取方法的不同,其抑菌和促菌活性作用不同导致结果存在差异[16]。菊苣叶的提取液中有效成分的作用方式和机制及其在活体植物上的抑菌活性,有待进一步研究和探讨。
4参考文献
[1] 刘海燕,高微微,樊瑛.植物源抑菌剂的研究进展[J].中国农学通报,2005,21(4):254-257,328.
[2] 顾海莎.植物源农药研究进展综述[J].安徽农业科学,2007,35(24):7520-7521.
[3] 苏秀,马良进,陈安良,等.山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究[J].浙江林学院学报,2008,25(3):355-358.
[4] 崔彦,王树桐,曹露,等.几种中草药提取物对黄瓜细菌性角斑病菌的抑制作用[J].中国农学通报,2008,24(5):308-312.
[5] 朱永坤.绿色农药仿生安在青岛诞生[J].北京农业,2006(11):40.
[6] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第八十卷,第一分册)[M].北京:科学出版社,1997.
[7] ZHANG Y,LIU K,WU L J.Advance in studies on Echinacea Moench[J].Chin Trad Herbal Drugs,2001,32(9):8522-8551.
[8] SOICKE H,AL-HASSAN G,GORLER K.Weitere kaffeesaure-deri-vate aus Echinacea purpurea[J].Planta Medica,1988,54(2):175-176.
[9] AHMED B,AL-HOWIRINY T A,SIDDIQUI A B.Antihepatotoxic activity of seeds of Cichorium intybus[J].J.Ethnopharmacol,2003,87(2-3):237-240.
[10] 叶国华,张冰,萨翼,等.高尿酸并高甘油三酯血症鹌鹑血液流变学的变化及菊苣提取物N2对其的影响[J].北京中医药大学学报,2004,27(3):37-39,90.
[11] EDELMAN J,JEFFORD T G.The mechanism of fructose metabolism in higher plants as exemplified in Helianthus tuberosus[J].New Physiolo-gist,1968(67):517-531.
[12] CARPITA N C,KANABUS J,HOUSLEY T L.Linkage structure of fructans and fructan oligomers from Triticum aestivum and Festuca arundinacea leaves[J].J.Plant Physiol.1989(134):162-168.
[13] 徐雅梅,呼天明,张存莉,等.菊苣根提取物的抑菌活性研究[J].西北植物学报,2006,26(3):615-619.
[14] 吴文君.植物化学保护技术导论[M].西安:陕西科技出版社,1998.
[15] 李永刚,文景芝,郝中娜.植物源抑菌剂的研究现状和展望[J].东北农业大学学报,2002,33(2):198-202.
[16] 韩建兴,祝木金,冯俊涛,等.27种植物抑菌活性初步筛选[J].西北农林科技大学学报,2002,30(6):134-137.