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[摘要] 目的 探讨端粒酶基因（hTERC）扩增与宫颈上皮内肿瘤（CIN）和宫颈癌发生发展的关系及临床意义。 方法 应用荧光原位杂交技术检测100例存在宫颈病变患者的宫颈脱落细胞中hTERC基因的扩增情况。 结果 100例各类宫颈细胞病变中，hTERC基因扩增比例分别为：CIN 1组13.3 %（4/30），CIN 2组71.0 %（22/31），CIN 3组和宫颈癌组均为100%（19/19，20/20），各组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。 结论 宫颈CIN和宫颈癌细胞hTERC基因均有扩增，且扩增率随病变的进展而增加；高级别CIN和癌的扩增率明显高于低级别CIN；检测hTERC基因扩增可以作为宫颈CIN和宫颈癌筛查及预后评估的重要指标。
[关键词] 宫颈上皮内肿瘤；宫颈癌；hTERC基因；荧光原位杂交技术
[中图分类号] R711.74 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）16-103-03
Clinical significance of hTERC gene amplification in cervical squamous epithelial cells detected by fluorescence in situ hybridization
ZHONG Shoujun LIU Xiaoping MI Xianjun DUAN Lifeng YANG Weihong CHEN Zhiqiang
Department of Pathology, the Bo"ai Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528403, China
[Abstract] Objective To study the relationship and clinical significance between human telomerase gene amplification and development of cervical intraepithelial neoplasm and cervical squamous cancer. Methods hTERC gene amplification were detected by FISH in cytological samples from 100 cases of CIN /cervical squamous cancer and 20 cases of normal cervix. Results In 100 cases of various types of cervical cell lesions, the abnormal amplification ratio of hTERC gene was: 13.3% (4/30) in CIN1 group, 71.0% (22/31) in CIN2 group, CIN 3 group and cervical cancer squamous group were 100% (19/19, 20/20), each group compare difference to all have statistical significance(P＜0.01). Conclusion hTERC gene was amplified both in CIN and cervical squamous cancer cells, and the amplification rate increases with lesion progression. The amplification rate of high grade CIN and squamous cancer was significantly higher than that of low grade CIN. Detection of hTERC gene amplification can be used as an important indicator in cervical CIN and cervical cancer screening and prognostic evaluation.
[Key words] Cervical intraepithelial neoplasm; Cervical cancer; hTERC gene; Fluorescence in situ hybridization
宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，是一个从宫颈CIN （CIN1→CIN2→CIN3）→早期浸润癌→浸润癌、由量变到质变的连续发展过程。肿瘤从根本上说是一类基因病，而染色体的异常则是各种肿瘤发生的基础。目前对宫颈癌遗传不稳定性的分析研究发现，在宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂的扩增，其中涉及到最重要的基因可能是端粒酶基因（hTERC）[1]。FISH是一种可以有效识别染色体畸变的细胞遗传学技术，能够提高细胞学的诊断效率与准确性[2]。本研究应用FISH检测不同病变类型的宫颈脱落细胞中hTERC基因的扩增情况，探讨其与宫颈CIN及宫颈癌发生发展的关系，为临床宫颈癌及癌前病变的筛查、早期发现及预后评估提供依据。
1 资料与方法
1.1 细胞学标本
收集笔者所在医院2008年3～12月行宫颈液基细胞学检测的异常细胞学标本100例，患者年龄19～63岁，平均（41.3±1.5）岁，其中CIN 80例（CIN1 30例、CIN2 31例、CIN3和原位癌19例），浸润性鳞状细胞癌20例。所有100例异常细胞学检测结果均经电子阴道镜下病理活组织检查诊断证实。另取同期在院体验的健康女性20例，宫颈细胞学检查结果正常，未见上皮内细胞病变（NILM）,建立正常阈值。
1.2 研究方法
1.2.1 细胞学标本采集 用细胞学专用宫颈刷在宫颈鳞柱交界处，以外口为中心，均匀旋转3～5周，取出宫颈刷洗入装有ThinPrip保存液的瓶中，经系统处理和过滤，细胞量控制在7万个以下，制成均匀的薄层涂片，95%酒精固定，HE染色，经细胞病理学诊断医师阅片判读，采用TBS分类标准签发细胞学报告。
1.2.2 阴道镜检查及病理活检组织学诊断 采用德国莱卡公司生产的mZ6型光学电子阴道镜检查评估。阴道镜显示异常图像如醋酸白色上皮、白斑、异型血管、镶嵌及碘不着色为阴道镜结果阳性，以阴道镜下病理活检组织学诊断为金标准。
1.2.3 FISH方法检测hTERC基因扩增 将TCT保存液瓶中剩余的液体，按照FISH检测的操作说明，进行细胞学制片、预处理、变性、杂交。hTERC探针为hTERC/CSP3 DNA双色探针，由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，其中hTERC DNA探针杂交到3号染色体3q26.3位点，CSP3 DNA探针杂交到3号染色体着丝粒（3p11.1-q11.1），两者分别以红色荧光信号（四甲基罗丹明）和绿色荧光信号（细胞绿）标记，用CSP3作为对照探针。
1.3 结果判断
于暗室中用OLYMPUS BX51荧光显微镜在 DAPI/FIFC/Texas Red 三色滤光镜激发下观察细胞学涂片中间期细胞的荧光杂交信号。采用北京金菩嘉医疗科技有限公司提供的 FISH图像分析软件进行分析处理，评估整个细胞学涂片中间期细胞的hTERC和CSP3 DNA双色探针杂交情况。正常单个间期细胞分别可见2个红色及绿色信号；若单个间期细胞红色信号大于2个，且绿色信号不少于2个则为hTERC基因异常扩增之细胞。阳性判断标准至少需计数荧光信号完整的200个细胞，若其中有40个以上异常细胞表现为 hTERC基因拷贝数的增加，即判定为阳性。
1.4 建立阈值
取20例同期宫颈NILM脱落细胞，用FISH方法进行hTERC基因检测，然后在荧光显微镜下随机观察计数100个细胞中红色信号数超过3的细胞数，统计异常细胞数的平均值及标准差，建立阈值。阈值=（均数+3×标准差）%，本研究所建阈值为4.33%。
1.5 统计学处理
应用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，两样本率的比较采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
CIN1组中hTERC基因的扩增率为13.3 %；CIN2组中hTERC基因扩增率为71.0 %；CIN3组及浸润性鳞癌组hTERC基因扩增率均为100.0%。见表1。其中大部分hTERC基因扩增为3倍体或4倍体扩增，少部分是5倍体或以上扩增。
3 讨论
临床实践表明宫颈癌的预防可以通过早期筛查和早期干预来实现。目前常用于宫颈癌及癌前病变筛查的方法有宫颈细胞学检查和高危型HPV病毒检测，前者属于形态学的方法，后者则属于病因学方面的检测。由于宫颈细胞学检查结果的假阴性率较高，且形态学的方法诊断主观性相对较强；另外，虽然高危型HPV病毒检测的敏感性较高，但相对特异性不够。因此寻找准确高效的宫颈癌筛查方法以达到早期诊断、早期干预的目的，从根本上降低宫颈癌的发病率和死亡率是多年来人们一直在努力追求的方向。
肿瘤从根本上说是一类基因病，发生的基础是由于各种原因所致的原癌基因激活或（和）肿瘤抑制基因失活的结果，宫颈癌的发生也是如此。临床已经证实HPV病毒的感染是导致宫颈CIN及宫颈癌发生的重要病因学要素。除了HPV感染，基因等方面的因素在宫颈癌前病变发展到癌的过程中也起到了十分重要的作用。对宫颈癌遗传不稳定性的分析研究发现宫颈癌中最常见的染色体畸变之一是染色体臂3q的畸变，而hTERC基因即定位于染色体3q26.3，该基因的扩增可以阻止细胞凋亡而导致肿瘤发生[3]。FISH是一种可以有效识别染色体畸变的细胞遗传学技术，可以提高细胞学的诊断效率与准确性。由于FISH技术相对简单、稳定、重复性好，并且可以不需要细胞培养而适用于染色体间期细胞，同时又具有较高的灵敏性及特异性，是以目前已成为一种常规细胞遗传学检测手段，在产前、产后遗传性疾病的诊断及血液肿瘤、实体瘤等方面的检测中广泛应用[2]。Heselmeyer-Haddad[4-5]首先将FISH方法用于宫颈细胞hTERC基因扩增的检测，发现63%的CIN2中有该基因的扩增，而76%的CIN3和原位癌中有该基因扩增，且hTERC基因扩增率及四倍体细胞数随着细胞学病变的严重程度而增加，可以作为预测宫颈高级别CIN的独立指标，并且认为特异性的基因组异常改变是宫颈癌前病变发展到浸润性癌所必备的条件之一。另有研究报道在宫颈腺癌细胞中也同样存在hTERC基因的扩增，其比例范围约为2.3～5.2，平均约为3.3，因此认为应用FISH方法检测hTERC基因扩增可以作为宫颈腺癌筛查的遗传学诊断手段[6]。
本研究中应用FISH方法检测了100例各类宫颈病变细胞中hTERC基因的扩增情况，结果发现在各级别宫颈CIN和宫颈鳞癌细胞中均存在有hTERC基因不同程度的扩增：CIN1组扩增率13.3%，CIN2组扩增率71.0%，而CIN3组和宫颈鳞癌组均为100%，且hTERC基因扩增率随着宫颈病变的进展程度而逐渐增加；高级别CIN和癌的扩增率明显高于低级别CIN，与文献研究报道结果一致[7-8]，表明FISH可以作为细胞学筛查的辅助手段，对于宫颈癌前病变的发现与早期诊断具有极大价值；另一方面，对于低级别宫颈CIN患者，如果检测存在有hTERC基因扩增，则宫颈病变向高级别CIN或癌进展的可能性较大。因此应用FISH方法检测hTERC基因扩增不但可以作为宫颈CIN和宫颈癌早期筛查的细胞遗传学手段，而且还可以用于预测低级别CIN向高级别CIN或癌进展的风险。
总之，由于FISH技术相对简单、稳定、重复性好，可以直接用于检测宫颈脱落细胞学涂片中的间期细胞，检测结果较为客观准确，同时又具有较高的敏感性和特异性，并且与临床病理诊断及细胞学诊断结果之间的符合率较高，因此FISH技术可以作为继宫颈细胞学及高危型HPV病毒检测之后的重要的宫颈癌筛查手段，同时还可以在一定程度上预测低级别CIN向高级别CIN或癌进展的风险。采用FISH方法检测宫颈细胞hTERC基因扩增有望成为临床工作中制定宫颈CIN和宫颈癌筛查措施、指导治疗及评估预后的重要依据。
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（收稿日期：2012-05-16）