摘要 [目的]分析成都平原主养草鱼、搭配鲫鱼池塘底泥中的细菌群落结构。[方法] 通过构建细菌16S rRNA基因克隆文库，对阳性克隆子进行多样性分析和构建系统发育树。[结果] 依据97%序列相似性划分OUT，所构建的文库共获得171个克隆子，并划分为14个OTUs（操作分类单元），其多样性指数Shannon（H）和优势度指数Simpson（D）分别为2.12和7.15，丰富度指数SChao1和SACE均为16。池塘底泥中主要的细菌类群为：梭杆菌门（24%）、变形菌门（55%）、浮霉菌门（10.5%）、绿弯菌门（5.9%）、拟杆菌门（2.3%）、放线菌门（1.8%）和厚壁菌门（0.6%）。 [结论]Cetobacterium 、Prolixibacter、Rhodocyclus、Candidate、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium和Sterolibacterium等属菌在脱氮除磷、降低硫化物、降解有机质等发挥重要作用。池塘底泥既是水生态系统修复功能菌的资源库，但也存在着Xanthomonas等致病性和功能未知的细菌库。
关键词 草鱼、鲫鱼；池塘底泥；16S rRNA；细菌多样性
中图分类号 S965.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05477-04
Abstract [Objective] The paper was to investigate bacterial community structure in Chengdu fishfarm sediment stocked with dominated Grass Carp and subordinate Crucian. [Method] Through the construction of 16S rRNA cloning library of bacteria， the positive clone was carried out community diversity analysis， and the phylogenetic tree was constructed. [Result] OUT （Operational Taxonomic Units） was classified according to sequences similarity of 97%， all 171
clones were clustered into 13 OTUs. The richness index Schao1 and SACE were 16 and 16， and the dominancy index （D） and diversity index （H） were 2.12 and 7.15， respectively. All sequences were respectively fell into the phylum of Fusobacteria （24%）， Proteobacteria （55%）， Planctomycetes （10.5%）， Chloroflexi （5.9%）， Bacteroidetes （2.3%）， Actinobacteria （1.8%） and Firmicutes （0.6%）. [Conclusion] The members of Cetobacterium， Prolixibacter， Rhodocyclus， Candidate， Planctomycetacia， Thiocapsa， Desulfomicrobium and Sterolibacterium play a key role in denitrogenation， phosphorus and sulfate reducing and organics degradation， while the Xanthomonas was an plant pathogen， this result suggested that the sediment was not only a bacterial source for ecological restoration， but also a reservoir for pathogenicity.
Key words Grass Carp and Crucian； Fishfarm sediment； 16S rRNA； Bacterial diversity
混养是指在同一个鱼塘混合养殖多种鱼类。混养是提高池塘养鱼产量的重要措施，也是目前我国池塘养鱼的技术特色，目前已获得了大面积推广与应用。混养具有以下优点：①可以充分利用池塘各个水层，发挥水体生产潜力；②全面合理利用池塘天然饵料资源，提高饵料利用率；③发挥养殖鱼类之间的共生互利关系，改善池塘生态环境；④降低养殖成本，增加经济收入[1]。然而，由于淡水养殖池塘是半静态、相对封闭的小型水体，自净能力较弱[2]。投饵施肥、生物排泄与死亡残骸的长期积累使得高密度的混养养殖模式水体中有机质含量超高[3]，致使自身的环境状况发生恶化，降低水体的利用效率，也使健康养殖存在一定的风险，甚至当养殖结束后养殖废水的排放会影响周围的生态环境。长期以来，许多学者对养殖系统中水质状况以及营养收支平衡进行了研究，以期达到养殖上以最小投入换来最大收益的目的，并提出通过改善饵料的加工及投喂方式来降低水质的污染速率，但该方法存在成本高、易引起二次污染等缺点。因此，为了提高水产养殖质量和效益，对人工养殖池塘生态系统尤其是池塘底泥微生物的研究已成为未来水产养殖行业的研究热点。
底泥微生物群落作为水产养殖生态系统的重要组成部分，在能量流动、物质循环、水质环境、疾病控制和污水管理等方面发挥着重要的作用[4]，此外也是评价养殖环境状况的重要生物检测指标[5]。因此，对人工养殖系统底泥微生物的研究越来越受到水产行业及科研人员的重视。程莹寅[4]、马英[6]等分别采用16S rRNA文库构建方法对主养草鱼池塘底泥微生物群落多样性、对虾养殖池沉积物细菌的遗传多样性进行研究。蔡莹[7]等在传统培养方法的基础上对虾池沉积物细菌的对太湖沉积物可培养方式进行改进并采用DGGE技术分析了虾池沉积物细菌的多样性。以上研究发现池塘底泥中微生物种类及功能的复杂性，从池塘养殖系统来看，水体中微生物不仅包含有益菌，而且包含致病性微生物。在池塘底泥微生物利用方面，范立民[8]从吉富罗非鱼养殖池塘底泥中分离出具有反硝化功能细菌脱氮硫杆菌。林亮[9]研究了芽孢杆菌对虾池底泥细菌群落的影响，发现芽孢杆菌制剂能够改善池塘底泥细菌类群的组成，提高对虾的成活率、体重和产量的提高。以上研究有助于了解池塘底泥微生物在水体净化过程中作用，开发利用微生物新资源。基于此，笔者利用16S rRNA免培养法分析成都新津主养草鱼、混搭鲫鱼的混养模式池塘底泥中细菌多样性及群落构成。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2013年7月中旬，使用重力式采泥器分别在四川省成都市新津县五津鱼养殖场采集主养草鱼、搭配鲫鱼池塘底部四角及中心部位采集底泥样品，采集后样品迅速密封，并置于干冰中运输至实验室，冻存于-80 ℃下保存备用。
1.2 底泥样品总DNA提取及16S rRNA基因PCR扩增
分别称取10 g池塘四角及中心部位底泥于无菌离心管中，置于漩涡混合器上振荡混匀，称取0.5 g混匀的底泥样品，用E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega， 美国）提取总DNA，具体方法参见试剂盒说明书。DNA抽提重复3次并混匀，以减少DNA在提取过程中产生的偏差。16S rRNA基因的PCR扩增条件及程序参考XIANG等描述方法[10]，将扩增产物用1.0%琼脂糖电泳进行检测，-20 ℃下保存。
1.3 16S rRNA 基因文库的构建
PCR产物经（纯化试剂盒）纯化后，依据pGEMT Easy Vector SystemⅠ（美国Promega 公司）说明书将PCR产物连接至pGEMT载体，并将重组质粒转化至感受态大肠杆菌E.coli JM109中，涂布于含氨苄青霉素、Xgal和IPTG的LB 平板上，筛选阳性克隆子。
1.4 16S rDNA测序和系统发育分析
挑选阳性克隆子，用Plasmid Mini Kit Ⅰ（美国Omega Inc）提取重组质粒，采用菌落PCR方法检测目的片段是否正确插入，挑选含有正确插入片段的重组质粒送交上海华津生物科技有限公司测序。所获得的序列用CLASSIFIER （RDP II， http：//rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp）进行分类，并提交至GenBank数据库中与已有序列经Blast进行同源性检索后，从相同序列中选取代表序列与数据库中典型菌株序列一起使用MEGA5.0软件中的Neighborjoining法进行1 000次步长计算构建系统发育树[11]。
2.2 16S rRNA基因克隆文库多样性分析
所构建的克隆文库共获得171个有效克隆序列，经BioEdit软件分析后共得到13个不同分类操作单元（OTUs）。多样性分析结果表明，该16S rRNA基因文库的最大OTU丰富度指数SChao1和SACE均为16，多样性指数（H）和优势度指数（D）分别为2.12和7.15，文库覆盖率为81.2%，可知该文库体现了池塘底泥中大部分的细菌菌群的多样性。从图2可以看出，曲线上升幅度逐渐平缓，OTU个数增加的幅度随着克隆子个数的增加而逐渐减小，表明文库基本趋近饱和，文库能覆盖样品中大部分的菌系，能够真实反映样品中细菌的多样性。因此，构建的16S rRNA克隆文库能够较好反映池塘底泥中细菌菌群结构。
3 讨论
底泥细菌作为水产养殖生态系统的重要组成部分，不仅参与养殖系统中有机质、无机盐等物质循环代谢及能量代谢，也影响养殖动物消化系统微生物菌群结构，因而与养殖动物的健康状况及水质保持密切相关。为探明成都平原主养草鱼、搭配鲫鱼养殖池塘底泥中细菌群落多样性及结构，笔者通过构建16S rRNA基因文库分析了成都新津主养草鱼、混搭鲫鱼的混养模式池塘底泥中细菌多样性及群落构成，并采用多样性指数H、优势度指数D、覆盖度C及稀释度曲线等对所建立的文库进行评估。结果表明，该16S rRNA基因文库多样性指数H和优势度指数D分别为2.12和7.15，文库覆盖率为81.2%，稀释度曲线减趋平缓，说明该研究方法及研究结果不仅展示出池塘底泥中细菌菌群的丰富多样，同时也能够体现池塘底泥菌群的结构类型和组织水平。
程莹寅[4]等研究发现主养草鱼池塘底泥中主要的细菌类群归属于7个细菌门类：变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门和浮霉菌门。该研究中主养草鱼、混搭鲫鱼的混养模式池塘底泥中细菌也包含了以上几个类群，在大的分类上和程莹寅等研究相同，但数量上差异较大，该研究中细菌的优势类群是变形菌门（55%）和梭杆菌门（24%），且变形菌门占有绝对的数量优势，尽管梭杆菌门在以前的报道中曾出现过，但很少作为主要优势类群。通过系统发育分析发现，池塘底泥中Cetobacterium属、Xanthomonas 属和Sulfuritalea属是其中的优势菌，所占比例为56.2%，目前还未见到池塘底泥中有这些属的报道。NI Jiajia等[13]曾在淡水鱼的消化道中分离到Cetobacterium somerae，能够产生唯一含矿物质的维生素B12调节鱼类新陈代谢，该菌存在于鱼类消化道可能是与池塘底泥中细菌相互影响的结果。黄单胞菌属（Xanthomonas）[14]是专门寄生在植物上的，也可以是腐生的，能够引发多种植物病害，目前虽尚未有对动物尤其是鱼类危害的报道，但对养殖系统中水生植物存在着潜在威胁，同时该菌所产生的黄原胶却可以广泛应用于食品、石油等工业。Hisaya Kojima[15]等曾在淡水湖中分离到Sulfuritalea属，该菌是一种兼性自型微生物，营养结构较简单。
除以上优势菌外，笔者还分离得到Sterolibacterium、Caldilinea aerophila、Streptomyces aomiensis、Thermolithobacter ferrireducens、Prolixibacter、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium、Rhodocyclus和 Alkalitalea属细菌，其中Prolixibacter属菌具有较好的NaCl耐受性，对营养物质要求比较低，同时还具有较强的降解BTEX类污染物的能力[16]，能够有效减少池塘受BTEX类化合物的污染。在水产养殖过程中，大量残饵、养殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有机物的含量，从而一方面造成水体中N、P元素的升高，在很大程度上加重了水体富营养化，甚至造成水产养殖对于环境的污染；另一方面，也增加了硫化物的含量，硫化物对鱼类生长危害较为严重，能够降低机体中血液的携氧能力，刺激、腐蚀鱼类的鳃组织。研究表明Sterolibacterium denitrificans是一种胆固醇降解菌，能够降解养殖动物死后固醇类物质的代谢；Rhodocyclus、Candidate和Planctomycetacia属的菌群具有脱氮除磷的功能；Thiocapsa、Desulfomicrobium属菌大多为厌氧菌，常存在于废水池、含硫温泉及湖泊等淡水环境中，具有降低水中硫化物的作用。因此它们在养殖水体生态环境修复、改善水质、提高水产养殖质量方面发挥着重要作用。其他属细菌也在参与水体中物质代谢，能量流动及微生物间相互作用发挥作用，例如Alkalitalea等具有纤维素降解功能等。
综上所述，成都平原主养草鱼、搭配鲫鱼池塘底泥中细菌种类很丰富，这些丰富的细菌可能执行着很复杂的功能，
为水生态系统中物质循环与能量流动做出了重大贡献。同时，池塘底泥中也存在许多潜在的致病性和未知的细菌，池塘底泥微生物对养殖鱼类的影响及机理值得进一步研究。
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