摘要
本研究对海南省澄迈县土沉香根结线虫病危害与发生情况进行了调查与研究，并采用比较形态学结合rDNAITS序列分析的方法对病原进行了分离鉴定，确定了发生在澄迈县土沉香苗木上的根结线虫为象耳豆根结线虫Meloidogyne enterolobii Yang & Eisenback。这是首次报道海南省澄迈地区土沉香上发生象耳豆根结线虫，为进一步分析土沉香病原根结线虫种群及该病的防治研究奠定了基础。
关键词
土沉香；象耳豆根结线虫；rDNAITS
中图分类号：
S 435.671
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.033
Abstract
The nematode species on Aquilaria sinensis in Chengmai County， Hainan Province was identified by morphological observation and rDNAITS sequence analysis. The results showed that the rootknot nematode occurred commonly on A.sinensis was Meloidogyne enterolobii Yang & Eisenback. This is the first report of M.enterolobii on A.sinensis in Hainan Province， which will be helpful to control the rootknot nematode of A.sinensis.
Key words
Aquilaria sinensis；Meloidogyne enterolobii；rDNAITS
土沉香Aquilaria sinensis，亦称白木香，俗称女儿香、莞香，属瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria spp.，其木材因饱含树脂而质量大，遇水即沉，且芳香之极。土沉香是我国特有的珍贵树种，也是生产中药沉香的唯一植物资源[1]，现已被列为国家珍稀濒危三级保护植物[2]及国家二级重点保护野生植物[3]。土沉香主要分布于我国华南地区，以海南、广东、云南、福建、广西、台湾等省区为主，其中海南种植面积最广，已成为我国沉香的代表性产区[4]。土沉香的人工种植在海南已经十余年，种植面积已超过2 000 hm2，遍布海南省各个市县。
2013年在海南省19个市（县）对包括土沉香在内的10个乡土树种的主要病虫害进行了调查，结果表明海口、屯昌、五指山、定安、东方、澄迈、保亭、万宁、昌江、三亚等地的土沉香均受到根结线虫的危害而呈现植株长势差、叶片失绿黄化、易感叶部病害等症状，尤其是部分苗圃基地的苗木感病严重，死亡率极高，达40%～60%。
我们在调查土沉香根结线虫发生情况的基础上，进一步对土沉香病原根结线虫进行分离、鉴定。通过对澄迈县主要土沉香育苗基地受根结线虫的危害情况调查及其病原根结线虫的分离鉴定，对土沉香苗木根结线虫病的发病症状进行了较为详细的阐述，并确定了澄迈地区一种新的土沉香病原根结线虫。
1材料与方法
1.1材料
病株样品：在海南省澄迈地区主要土沉香育苗基地（以海南国营澄迈林场为主）采集染病袋装苗连同基质一起放入封口袋内，做好标记带回实验室。
供试番茄苗：市场采购的普通樱桃番茄种子，在灭菌土中培养。
1.2方法
1.2.1土沉香根结线虫病的调查及供试虫源准备
在海南省澄迈县土沉香主要育苗基地对土沉香苗木根结线虫病的发生情况展开调查。在显微镜下从采集的染病袋装苗上挑取单卵块接种在灭菌土中，将刚长出两片真叶的番茄幼苗移入接种土中培养，进行种群纯化培养与活体保存[5]。
1.2.2土沉香根结线虫的获得
雌虫的分离与收集：经单卵块接种后的番茄苗培养40 d后，取侵染的番茄根用清水洗净，在体视显微镜下用镊子或解剖针针尖将根结表皮轻轻挑开，剖面出现的乳白色的光滑梨形物即为根结线虫的雌虫，用解剖针轻轻拨出，放入水中待用。
2龄幼虫的收集：2龄幼虫由单卵块孵化获得，参照王曦茁等的方法[6]。
1.2.3形态学观察
雌成虫与2龄幼虫的主要形态特征观察：包括雌成虫头部、口针特征等；2龄幼虫头部、尾部特征等。分别测量20条成虫与2龄幼虫的体长、最大体宽、口针长和DEGO（背食道腺开口至口针基部球的距离）等形态指标。
雌成虫会阴花纹的制作与观察：参照张绍升的方法[7]，从新鲜的染病番茄根组织挑取成熟雌虫，置于滴有40%乳酸溶液的载玻片上，在体视显微镜下，用解剖针和双面刀切取下尾端（虫体后部约1/4处），将尾端的体内组织用发针去掉，并切除尾端表皮多余部分，把会阴花纹部分转移至滴有纯甘油的载玻片上展平，制成临时玻片在显微镜下观察拍照。
1.2.4分子生物学鉴定
根结线虫DNA提取，参照王曦茁等[6]与章淑玲等[8]的方法，稍作修改：配制线虫裂解液（10 mmol/L TrisHCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0， 0.25 mmol/L NaCl pH 8.0， 1% SDS），5℃保藏，待用。在体视显微镜下挑取单条成熟雌成虫，置于滴有无菌水的载玻片上，用无菌水冲洗3次后，转移至灭菌的1.5 mL离心管中，加入10 μL无菌水，4 μL预冷的裂解液，用灭菌解剖针将雌虫刺破，加入2 μL的1 mg/mL 蛋白酶K（天根公司），并迅速放入-20℃冰箱中过夜。然后置于65℃水浴锅中1 h，95℃水浴10 min使蛋白酶变性，最后以12 000 r/min离心2 min，取其上清用于PCR扩增或于-20℃保存備用。
基因选择及目的片段扩增与测序：参照王曦茁等[6]、Shi 等[9]的研究结果，对所分离筛选获得的根结线虫，选择核糖体转录间隔区（ITS）进行扩增与测序，PCR扩增引物为 V5367： 5′TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT3′和26S： 5′TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG3′[9]，由上海铂尚生物技术有限公司合成。反应体系及条件参见王曦茁等的方法[6]。PCR产物委托上海铂尚生物技术有限公司测序。
ITS基因系统发育树构建：将本试验分离的根结线虫ITS序列（编号为HN150805），与GenBank数据库中根结线虫ITS序列进行比对分析，分别选取南方根结线虫M.incognita ITS序列（KP751204、KP179223），北方根结线虫M.hapla ITS序列（LC030362、LC030358），花生根结线虫M.arenaria ITS序列（LC03035、LC030356），爪哇根結线虫M.javanica ITS序列（AF387094、AY829375），西班牙根结线虫M.hispanica ITS序列（EU443614、EU443612），象耳豆根结线虫ITS序列（KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369），以秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans（X03680）的ITS序列作为外群，共16个序列，采用MEGA 5.1软件通过邻接法（neighborjoining）构建系统发育树，以自展法（bootstrap）进行1 000次循环检测。
2结果与分析
2.1土沉香根结线虫发病症状
调查发现澄迈县的部分土沉香育苗基地的土沉香1年生小苗或2年生大袋苗出现植株矮小，叶片黄化失绿，生长缓慢，甚至植株枯死的现象，且罹病苗木易患其他叶部病害，严重苗圃死亡率达40%～60%。受害土沉香苗木根部会形成许多大小形状不定、表面粗糙的根结，有的连接成块，随着病情的加重，根部坏死表现为疏松多孔，大部分2年生的罹病大袋苗的根颈部会形成畸形的瘤块，有的瘤块处的直径是正常处2倍多，表皮纵裂。取根结在体视显微镜下切开能看见白色梨形雌虫，或取受害土沉香苗土用贝曼漏斗处理约24 h，镜检会观察到大量线形幼虫或雄虫。
2.2形态学特征
雌虫：乳白色，呈梨形，颈明显突出，头区无环纹，唇盘圆盘状，略突起，口针细长，基部球粗大，椎体部与杆部等长。
2龄幼虫：蠕虫形，体环清晰，头区略缢缩，口针细长，基部球大而圆，体部与杆部分界明显，尾部透明区明显，尾尖钝圆。
会阴花纹：为近圆的六边形至卵圆形，线纹较紧密，呈波浪形，连续或间断，背弓较高，侧线不明显，尾端区通常有刻点。
2.3分子生物学特征
利用通用引物V5367和26S对样品HN150805的rDNAITS区域进行扩增，得到约750 bp的片段，经双向测序及拼接得到694 bp，通过BLAST比对分析，发现该序列（NCBI序列号为KU321697）与象耳豆根结线虫（KT354573、KP411227、KJ146863、KF418369）完全相同。系统发育树显示样品HN150805，与象耳豆根结线虫位于同一分支，支持率为100%。
3结论与讨论
本研究对海南省澄迈县土沉香主要育苗基地的土沉香苗木感染根结线虫病的情况进行了调查，发现这些地区的土沉香苗圃均受到根结线虫不同程度的危害，试验对土沉香苗木患根结线虫病的症状作了较为详细的描述，对土沉香苗木根结线虫病的诊断与防治有一定的指导意义。在此基础上本研究运用形态学结合rDNAITS序列分析的方法，将采自澄迈县罹病土沉香苗木上的线虫鉴定为象耳豆根结线虫，为该病原线虫的进一步研究奠定了基础。
1994年吴影梅等[10]认为广东、海南两省的白木香病原根结线虫有南方根结线虫和爪哇根结线虫两种；2011年，许天委等[11]认为海南省白木香受到南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫等3种病原线虫的危害。均认为海南省的土沉香根结线虫是复合侵染型，而本研究仅鉴定出象耳豆根结线虫1种病原。我们认为这样的结果并不矛盾，本试验在之前形态学鉴定的基础上结合了分子生物学特征的分析，试验结果具有更高的准确性；且有报道称象耳豆根结线虫已成为海南省蔬菜作物上一个主要的根结线虫病原种，在海南全岛普遍发生[1213]。本试验之所以只鉴定出1个病原种，可能是因为象耳豆根结线虫已成为该地区土沉香的优势病原根结线虫，在挑取卵块于番茄上纯化分离时，挑取的恰好是象耳豆根结线虫卵块。在此基础上，我们已开展了土沉香病原根结线虫种群结构分析研究与生物防治研究。
象耳豆根结线虫于1983年由Yang和Eisenback[14]在中国海南岛的青皮象耳豆树Enterolobium contortisiliquum （Vell.） Morong根部首次发现并描述，定名为M.enterolobii；Rammah和Hirschmann[15]于1988年在波多黎各岛从一种茄子Solanum melongena L.上分离并描述，定名为M.mayaguensis。2004年，Brito等[16]在佛罗里达州分离的4个M.mayaguensis隔离种群的形态特征与1983年Yang & Eisenback 描述的象耳豆根结线虫一致。2012年，Karssen 和Liao[17]对Rammah和Hirschmann 描述的M.mayaguensis与Yang 和Eisenback描述的M.enterolobii的雌虫、雄虫、2龄幼虫的形态特征进行了全面、详细的比较，揭示了这两个原种描述上的差异，并最终确定此二者为同物异名，M.mayaguensis是次异名，统一使用M.enterolobii作为象耳豆根结线虫的拉丁文名。
象耳豆根结线虫作为一种多寄主的病原根结线虫，具有强致病力而且还能克服线虫Mi抗性基因[18]，对农作物造成毁灭性的危害。自1983首次在青皮象耳豆树上发现以后，其寄主范围与发生地区以极快的速度不断扩大[1922]，尤其在福建[23]、海南和广东[13，24]等热带、亚热带地区，该线虫无越冬现象，常年危害作物，已成为热带和亚热带地区最重要的根结线虫之一。欧洲和地中海植物保护组织发布的资料显示[25]，除中国以外，四大洲的亚热带地区也有象耳豆根结线虫发生，且其寄主包括大豆、咖啡、棉花、烟草等在内的许多世界性农作物与经济作物，EPPO已将其列为检疫性线虫。
本研究详细阐述了土沉香根结线虫病的发生症状，对生产实践中土沉香根结线虫病的识别与诊断有一定的参考价值。同时首次确认了海南省澄迈地区土沉香的病原根结线虫是象耳豆根结线虫，为土沉香根结线虫病的进一步研究与防治提供了新的依据。鉴于土沉香根结线虫病的严重危害性，在明确其病原的基础上，高效无公害的治疗措施以及可持续的控制方法研究将是未来防治土沉香根结线虫病乃至象耳豆根结线虫的关键。
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